第二章 酶学与酶工程 (4-6节)
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Enzyme Engineering 酶工程
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第二章 酶学与酶工程
第一节 酶的分类、组成、结构特点和作用机制 第二节 酶作为催化剂的显著特点 第三节 酶抑制作用的概念和分类 第四节 可逆抑制作用 第五节 不可逆抑制作用 第六节 酶抑制剂的应用
退出
第四节 可逆抑制作用
一 竞争性抑制作用 二 反竞争性抑制 三 非竞争性 三 其他可逆抑制
阻断了底物和酶的结合 3 降低酶和底物的亲和力。
退出
3. 竞争性抑制作用举例
举例某些药物或体内代谢物对酶的竞争性抑制作用
药物（抑制剂）
被抑制的酶
竞争底物
临床应用及机理
磺胺药 氨基蝶呤
二氢叶酸合成酶（细 菌）
二氢叶酸还原酶
苯甲酸 二氢叶酸
抗菌作用（抑制四氢 叶酸）
抗白血病
5-氟尿嘧啶（5-FU）
所谓过渡态底物是指底物和酶结合成中间复 合体后被活化的过渡形式，一般用S*表示， 由于其能障小，和酶结合就紧密得多。
退出
4．过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
退出
4．过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
退出
二. 反竞争性抑制
退出
2. 反竞争性抑制举例
2．举例：
单底物酶：如芳香基硫酸基的肼解
退出
青霉素酰化酶的催化活性中心
采用多底物竞争性抑制
用X晶体衍射测定了复合物（青霉素酰化酶和底物苯乙酸，3，4二羟 基苯乙酸，2，5二羟基苯乙酸，p－硝基苯乙酸)的三维结构，
这些复合物揭示了底物结合区域构象的变化可能作为酶自催化的开 关。显示了催化中心中的Asn B241的作用。PGA活性高度依赖于 Asn B241，在催化中心里，B241 Asn导致形成阳离子的洞，包括底 物与Ser B1。Arg A263参与了与底物的结合并协助Asn B241的定位。 Phe 146是底物进入活性中心的开关，所以准确地说，青霉素酰化酶 的催化活性中心是Ser-Asn二联体。
S
N O
COOH
PGA
NH2 H
N
S
O
N
O
Cephalexin COOH
图 1.2 酶法生产β-内酰胺类抗生素路线图
Figure 1.2. The network of enzymatic modification of β-lactam antibiotics 退出 PGA for penecillin G acylase; 6-APA for 6-aminopenicillinic acid; 7-ADCA for 7-
传统化学法生产β－内酰胺抗生素路线
Sucrose. Phenylacetic acid
H
(2 Chemical steps)
O
Fermentation (Penicillium)
Diastereometic Crystallization
PhCH2 C HN O
Penicillin G O
PhCH2 C HN
退出
第五节结束
非专一性的不 可逆抑制作用
酰化剂 烃基化剂 含活泼双键的试剂 亲电试剂 氧化剂 还原剂
专一性不可逆 抑制剂的类型
Ks型专一性不可逆抑制剂 Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物）
退出
第五节结束
点击返回
退出
第六节 酶抑制剂的应用
一 医学上的应用 二 农业生产上的应用 三 工业生产上应用
底物）
退出
1． Ks型结合型专一性不可逆抑制剂
抑制剂只能专一地与某种酶结合而引起的不可逆抑 制作用
举例：
1 对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮抑制胰凝乳蛋白酶 2 对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮抑制胰蛋白酶
退出
2． Kcat型催化型不可逆抑制剂（自杀 底物）
抑制剂能专一地与某种酶结合并发生催化反应，而反应 的产物中含有一个基团可以与酶分子活性中心的基团共 价结合，导致酶分子不可逆地丧失催化活性。
through a tetrahedral transition state, which is further stabilized by the H-bonds to Asn_241 and Ala_69. The
退出
tetrahedral intermediate then forms a seryl-acyl enzyme and releases the 6-APA. The acyl enzyme is attacked by water to form a second tetrahedral intermediate by the same mechanism with the interaction of
退出
青霉素酰化酶催化机制
图 1.6 青霉素酰化酶催化水解青霉素G机理示意图
Figure 1.6 The mechanics of hydrolysis of penicillin G by penicillin acylase
The carbonyl carbon atom of the amide bond is attacked by the Ser_1 and aovalent acyl-enzyme is formed
OC2H5
O
H2N
S
H2N
S
COCl
HN CH3
HN CH3
N O
COOH
6-APA
N
O
CH3
COOH
7-ADCA
O C(CH3)3
O C(CH3)3
D-phenylglycine chloride
OO
hydrochloride
Dane anhydride
OO
HO Dane anhydride
Semi-Synthetic Penicillins and Cephalosporins
图 1.1 传统化学法生产β－内酰胺抗生素路线
Figure 1.1. An overview of the traditional, chemical synthesis of β-lactam
退出
antibiotics
酶法生产β-内酰胺类抗生素路线图
Fermentation
NH2 COOH
N
H
S
Asn _241 and Ala_69. Finally, this intermediate collapses to release the PAA. Dotted lines represent
aminodeacetoxi-cephalospornic acid; 7-ACA for 7-aminocephalospornic acid
青霉素G酰化酶在大肠杆菌中的合成与后加 工
图1.3 青霉素G酰化酶在大肠杆菌中的合成与后加工
Fig. 1.3 Synthesis and maturation of penicillin G acylase in E. coli.：The pac gene from
尿嘧啶核苷磷酸化酶 （胸腺嘧啶核苷 磷酸化酶）
尿嘧啶（胸腺嘧啶）
抗癌作用（抑制核苷 酸合成）
别嘌呤醇
黄嘌呤氧化酶
黄嘌呤，次黄嘌呤
抗通风（抑制尿酸生 成）
6-氨基已酸
纤溶酶
-赖氨酸-氨基酰
止血，抗纤溶（抑制 纤溶酶）
苯丙胺（麻黄素）
退出
单胺氧化酶
肾上腺素（去甲肾上 腺素）
中枢兴奋，抗哮喘
4．过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
O O
N
O
COOH O
DAAO
N
H
S
O O
N
O
COOH O
GL-7ACCA
H2N O
S
N
O
COOH O
PGA
NH2
H
N
S
OON
O
COOH O
Caphalothin
H N
O O
S N
COOH
H2N O
S N
COOH
PGA
NH2 H N
O O
Ampicillin
S N
COOH
H
N
S
O
N
O
COOH
PGA
H2N
氰化物抑制芳香硫酸酯酶的作用
多底物：如双底物乒乓机制中，任何一个底 物的竞争性抑制剂也是另一底物的反竞争性 抑制剂。
退出
三. 非竞争性抑制
Ki=Ki’
退出
2. 非竞争性抑制举例
退出
四．混合型抑制
退出
五． 其他可逆抑制 1． 部分抑制 2． 底物抑制 3． 产物抑制
退出
1． 部分抑制
S
S Ring Expansion O
N
N
(2 Chemical Steps)
O
CH3
COO-K+
Cephalosporin G COOH
Deacylation (4 Chemical Steps)
Deacylation (4 Chemical Steps)
NH2 H
COOH
+
HO
O
NH2
Protection, activation (2 Chemical steps)
不可逆作用可分为 非专一性 专一性
退出
一. 非专一性的不可逆抑制作用
1． 概念：抑制剂能和酶上的一类或几类基团 反应。
2 类型：：酰化剂、烃基化剂、含活泼双键 的试剂、 亲电试剂、 氧化剂、 还原剂
退出
二． 专一性不可逆抑制剂
专一性不可逆抑制剂的类型: 1． Ks型结合型不可逆抑制剂 2． Kcat型催化型不可逆抑制剂（自杀
1． 部分抑制：假如混合型抑制中ESI复合物 也能释放产物即为部分抑制。
退出
2． 底物抑制
退出
3． 产物抑制
3． 产物抑制：产物对酶反应的抑制作用在生 物体中较为常见，在细胞内，酶反应的产物 虽然不断被另外的酶作用，但S和P总是同时 存在的，因此，考虑产物对反应速度的影响， 可能具有一定的意义。
退出
一 竞争性抑制作用
1.竞争性抑制作用的含义 2. 竞争性抑制作用的机理 3. 竞争性抑制作用举例 4．过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
退出
1.竞争性抑制作用的含义
退出
2. 竞争性抑制作用的机理
竞争性抑制的机理
1 抑制剂与底物在结构上有类似之处 2 可能结合在底物所结合的位点（如结合基团）上，从而
退出
第四节结束
竞争性抑制作 用
1．竞争性抑制的含义 2．竞争性抑制的机理 3．竞争性抑制举例 4．过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
Baidu Nhomakorabea
反竞争性抑制
1．概念 2．举例
非竞争性抑制 混合型抑制 其他可逆抑制
1． 部分抑制 2． 底物抑制 3． 产物抑制
退出
第四节结束
点击返回
退出
第五节 不可逆抑制作用
退出
peptide (C), and β subunit (β).
青霉素酰化酶的三维结构图
图 1.4 青霉素酰化酶的三维结构图 Figure 1.4. The three-dimensional structure of penicillin acylase MOLSCRIPT representation of the heterodimer. The A chain is shown in red wrapped aroud
COOH
O
+ NH3
OH Mannich
HO
Diastereometic Crystallization
NH2 COOH
NH2 COOH
Protection, activation (2 Chemical steps)
OC2H5
NH3Cl-
O
HO
Protection, activation (2 Chemical steps)
退出
Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物）
（1） 天然酶的自杀底物 （2） 治疗用人工合成的酶自杀底物
退出
（1） 天然酶的自杀底物
Ackee(Blighia sapida) 植物——未成熟果实的假种 皮中含有一种有毒的降糖氨酸（即甲叉环丙基丙氨 酸）
退出
（2） 治疗用人工合成的酶自杀底物
治疗高血压；癫痫；抗青霉素的菌株；在肿 瘤治疗上；治疗震颠麻痹症；痛风症的自杀 底物疗法。
E. coli encodes a polypeptide precursor (preproPAC) which is composed of, in the
direction of N-terminus to C-terminus, a signal peptide (S), α subunit (α), connecting
the B chain (blue)。 退出 （Duggleby, H.J. Nature, 1995, (373):264-268）.
青霉素酰化酶的结构
不同来源的青霉素酰化酶都有α，β两个亚基组成，α亚基 的分子量在24k左右，β亚基的分子量在65k左右。
E. coli来源的PGA结构基因全长2538个核苷酸，编码846 个氨基酸组成的前体蛋白，包括26个氨基酸组成的信号 肽，209个氨基酸组成的α亚基，54个氨基酸组成的连接 肽和557个氨基酸组成的β亚基。
退出
一 医学上的应用
1． 青霉素类药物
长期使用青霉素，细菌中产生β-内酰胺酶，可水解青霉 素中的内酰胺环，使之成为不杀菌的青霉酸酰。（不能
形成D-丙氨酸-D-丙氨酸结构，丧失了杀菌能力）
退出
1． 青霉素类药物
退出
1． 青霉素类药物
两者结构类似，故可竞争性地抑制转肽酶，导致胞壁合成障碍。
退出
退出
第二章 酶学与酶工程
第一节 酶的分类、组成、结构特点和作用机制 第二节 酶作为催化剂的显著特点 第三节 酶抑制作用的概念和分类 第四节 可逆抑制作用 第五节 不可逆抑制作用 第六节 酶抑制剂的应用
退出
第四节 可逆抑制作用
一 竞争性抑制作用 二 反竞争性抑制 三 非竞争性 三 其他可逆抑制
阻断了底物和酶的结合 3 降低酶和底物的亲和力。
退出
3. 竞争性抑制作用举例
举例某些药物或体内代谢物对酶的竞争性抑制作用
药物（抑制剂）
被抑制的酶
竞争底物
临床应用及机理
磺胺药 氨基蝶呤
二氢叶酸合成酶（细 菌）
二氢叶酸还原酶
苯甲酸 二氢叶酸
抗菌作用（抑制四氢 叶酸）
抗白血病
5-氟尿嘧啶（5-FU）
所谓过渡态底物是指底物和酶结合成中间复 合体后被活化的过渡形式，一般用S*表示， 由于其能障小，和酶结合就紧密得多。
退出
4．过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
退出
4．过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
退出
二. 反竞争性抑制
退出
2. 反竞争性抑制举例
2．举例：
单底物酶：如芳香基硫酸基的肼解
退出
青霉素酰化酶的催化活性中心
采用多底物竞争性抑制
用X晶体衍射测定了复合物（青霉素酰化酶和底物苯乙酸，3，4二羟 基苯乙酸，2，5二羟基苯乙酸，p－硝基苯乙酸)的三维结构，
这些复合物揭示了底物结合区域构象的变化可能作为酶自催化的开 关。显示了催化中心中的Asn B241的作用。PGA活性高度依赖于 Asn B241，在催化中心里，B241 Asn导致形成阳离子的洞，包括底 物与Ser B1。Arg A263参与了与底物的结合并协助Asn B241的定位。 Phe 146是底物进入活性中心的开关，所以准确地说，青霉素酰化酶 的催化活性中心是Ser-Asn二联体。
S
N O
COOH
PGA
NH2 H
N
S
O
N
O
Cephalexin COOH
图 1.2 酶法生产β-内酰胺类抗生素路线图
Figure 1.2. The network of enzymatic modification of β-lactam antibiotics 退出 PGA for penecillin G acylase; 6-APA for 6-aminopenicillinic acid; 7-ADCA for 7-
传统化学法生产β－内酰胺抗生素路线
Sucrose. Phenylacetic acid
H
(2 Chemical steps)
O
Fermentation (Penicillium)
Diastereometic Crystallization
PhCH2 C HN O
Penicillin G O
PhCH2 C HN
退出
第五节结束
非专一性的不 可逆抑制作用
酰化剂 烃基化剂 含活泼双键的试剂 亲电试剂 氧化剂 还原剂
专一性不可逆 抑制剂的类型
Ks型专一性不可逆抑制剂 Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物）
退出
第五节结束
点击返回
退出
第六节 酶抑制剂的应用
一 医学上的应用 二 农业生产上的应用 三 工业生产上应用
底物）
退出
1． Ks型结合型专一性不可逆抑制剂
抑制剂只能专一地与某种酶结合而引起的不可逆抑 制作用
举例：
1 对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮抑制胰凝乳蛋白酶 2 对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮抑制胰蛋白酶
退出
2． Kcat型催化型不可逆抑制剂（自杀 底物）
抑制剂能专一地与某种酶结合并发生催化反应，而反应 的产物中含有一个基团可以与酶分子活性中心的基团共 价结合，导致酶分子不可逆地丧失催化活性。
through a tetrahedral transition state, which is further stabilized by the H-bonds to Asn_241 and Ala_69. The
退出
tetrahedral intermediate then forms a seryl-acyl enzyme and releases the 6-APA. The acyl enzyme is attacked by water to form a second tetrahedral intermediate by the same mechanism with the interaction of
退出
青霉素酰化酶催化机制
图 1.6 青霉素酰化酶催化水解青霉素G机理示意图
Figure 1.6 The mechanics of hydrolysis of penicillin G by penicillin acylase
The carbonyl carbon atom of the amide bond is attacked by the Ser_1 and aovalent acyl-enzyme is formed
OC2H5
O
H2N
S
H2N
S
COCl
HN CH3
HN CH3
N O
COOH
6-APA
N
O
CH3
COOH
7-ADCA
O C(CH3)3
O C(CH3)3
D-phenylglycine chloride
OO
hydrochloride
Dane anhydride
OO
HO Dane anhydride
Semi-Synthetic Penicillins and Cephalosporins
图 1.1 传统化学法生产β－内酰胺抗生素路线
Figure 1.1. An overview of the traditional, chemical synthesis of β-lactam
退出
antibiotics
酶法生产β-内酰胺类抗生素路线图
Fermentation
NH2 COOH
N
H
S
Asn _241 and Ala_69. Finally, this intermediate collapses to release the PAA. Dotted lines represent
aminodeacetoxi-cephalospornic acid; 7-ACA for 7-aminocephalospornic acid
青霉素G酰化酶在大肠杆菌中的合成与后加 工
图1.3 青霉素G酰化酶在大肠杆菌中的合成与后加工
Fig. 1.3 Synthesis and maturation of penicillin G acylase in E. coli.：The pac gene from
尿嘧啶核苷磷酸化酶 （胸腺嘧啶核苷 磷酸化酶）
尿嘧啶（胸腺嘧啶）
抗癌作用（抑制核苷 酸合成）
别嘌呤醇
黄嘌呤氧化酶
黄嘌呤，次黄嘌呤
抗通风（抑制尿酸生 成）
6-氨基已酸
纤溶酶
-赖氨酸-氨基酰
止血，抗纤溶（抑制 纤溶酶）
苯丙胺（麻黄素）
退出
单胺氧化酶
肾上腺素（去甲肾上 腺素）
中枢兴奋，抗哮喘
4．过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
O O
N
O
COOH O
DAAO
N
H
S
O O
N
O
COOH O
GL-7ACCA
H2N O
S
N
O
COOH O
PGA
NH2
H
N
S
OON
O
COOH O
Caphalothin
H N
O O
S N
COOH
H2N O
S N
COOH
PGA
NH2 H N
O O
Ampicillin
S N
COOH
H
N
S
O
N
O
COOH
PGA
H2N
氰化物抑制芳香硫酸酯酶的作用
多底物：如双底物乒乓机制中，任何一个底 物的竞争性抑制剂也是另一底物的反竞争性 抑制剂。
退出
三. 非竞争性抑制
Ki=Ki’
退出
2. 非竞争性抑制举例
退出
四．混合型抑制
退出
五． 其他可逆抑制 1． 部分抑制 2． 底物抑制 3． 产物抑制
退出
1． 部分抑制
S
S Ring Expansion O
N
N
(2 Chemical Steps)
O
CH3
COO-K+
Cephalosporin G COOH
Deacylation (4 Chemical Steps)
Deacylation (4 Chemical Steps)
NH2 H
COOH
+
HO
O
NH2
Protection, activation (2 Chemical steps)
不可逆作用可分为 非专一性 专一性
退出
一. 非专一性的不可逆抑制作用
1． 概念：抑制剂能和酶上的一类或几类基团 反应。
2 类型：：酰化剂、烃基化剂、含活泼双键 的试剂、 亲电试剂、 氧化剂、 还原剂
退出
二． 专一性不可逆抑制剂
专一性不可逆抑制剂的类型: 1． Ks型结合型不可逆抑制剂 2． Kcat型催化型不可逆抑制剂（自杀
1． 部分抑制：假如混合型抑制中ESI复合物 也能释放产物即为部分抑制。
退出
2． 底物抑制
退出
3． 产物抑制
3． 产物抑制：产物对酶反应的抑制作用在生 物体中较为常见，在细胞内，酶反应的产物 虽然不断被另外的酶作用，但S和P总是同时 存在的，因此，考虑产物对反应速度的影响， 可能具有一定的意义。
退出
一 竞争性抑制作用
1.竞争性抑制作用的含义 2. 竞争性抑制作用的机理 3. 竞争性抑制作用举例 4．过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
退出
1.竞争性抑制作用的含义
退出
2. 竞争性抑制作用的机理
竞争性抑制的机理
1 抑制剂与底物在结构上有类似之处 2 可能结合在底物所结合的位点（如结合基团）上，从而
退出
第四节结束
竞争性抑制作 用
1．竞争性抑制的含义 2．竞争性抑制的机理 3．竞争性抑制举例 4．过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
Baidu Nhomakorabea
反竞争性抑制
1．概念 2．举例
非竞争性抑制 混合型抑制 其他可逆抑制
1． 部分抑制 2． 底物抑制 3． 产物抑制
退出
第四节结束
点击返回
退出
第五节 不可逆抑制作用
退出
peptide (C), and β subunit (β).
青霉素酰化酶的三维结构图
图 1.4 青霉素酰化酶的三维结构图 Figure 1.4. The three-dimensional structure of penicillin acylase MOLSCRIPT representation of the heterodimer. The A chain is shown in red wrapped aroud
COOH
O
+ NH3
OH Mannich
HO
Diastereometic Crystallization
NH2 COOH
NH2 COOH
Protection, activation (2 Chemical steps)
OC2H5
NH3Cl-
O
HO
Protection, activation (2 Chemical steps)
退出
Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物）
（1） 天然酶的自杀底物 （2） 治疗用人工合成的酶自杀底物
退出
（1） 天然酶的自杀底物
Ackee(Blighia sapida) 植物——未成熟果实的假种 皮中含有一种有毒的降糖氨酸（即甲叉环丙基丙氨 酸）
退出
（2） 治疗用人工合成的酶自杀底物
治疗高血压；癫痫；抗青霉素的菌株；在肿 瘤治疗上；治疗震颠麻痹症；痛风症的自杀 底物疗法。
E. coli encodes a polypeptide precursor (preproPAC) which is composed of, in the
direction of N-terminus to C-terminus, a signal peptide (S), α subunit (α), connecting
the B chain (blue)。 退出 （Duggleby, H.J. Nature, 1995, (373):264-268）.
青霉素酰化酶的结构
不同来源的青霉素酰化酶都有α，β两个亚基组成，α亚基 的分子量在24k左右，β亚基的分子量在65k左右。
E. coli来源的PGA结构基因全长2538个核苷酸，编码846 个氨基酸组成的前体蛋白，包括26个氨基酸组成的信号 肽，209个氨基酸组成的α亚基，54个氨基酸组成的连接 肽和557个氨基酸组成的β亚基。
退出
一 医学上的应用
1． 青霉素类药物
长期使用青霉素，细菌中产生β-内酰胺酶，可水解青霉 素中的内酰胺环，使之成为不杀菌的青霉酸酰。（不能
形成D-丙氨酸-D-丙氨酸结构，丧失了杀菌能力）
退出
1． 青霉素类药物
退出
1． 青霉素类药物
两者结构类似，故可竞争性地抑制转肽酶，导致胞壁合成障碍。
退出