RNA聚合酶
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RNA聚合酶
一、来源
• 来源于噬菌体感染宿主后所产生
Байду номын сангаас
• SP6噬菌体聚合酶 噬菌体聚合酶 • 来源于感染鼠伤寒沙门氏菌 来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株 菌株 • • T3或T7噬菌体聚合酶 或 噬菌体聚合酶 • 来源于感染的大肠杆菌
二、活性与用途
• 这些 这些RNA聚合酶实际上为转录过程中 聚合酶实际上为转录过程中 RNA合成的酶，识别 合成的酶， 合成的酶 识别DNA中特异的启 中特异的启 动子序列，并沿此dsDNA模板起始 动子序列，并沿此 模板起始 RNA的合成 的合成。 的合成 • 与DNA聚合酶不同，无需引物，但识 聚合酶不同， 聚合酶不同 无需引物， 别特异性位点
• • •
② 体内：用于表达外源基因 体内： A. Ecoli 先构建宿主菌，将T7 poly RNA基因 先构建宿主菌， 基因 启动子之下，插入到λ 置于 lacUV5 启动子之下，插入到λ 噬菌体中，感染E.coli建立稳定的溶 噬菌体中，感染 建立稳定的溶 原菌 • Ecoli BL21(DE3)：lacUV5启动子 ： 启动子 +T7RNA聚合酶基因，置于λ噬菌体 聚合酶基因， 聚合酶基因 置于λ DE3区，该区整合于染色体的 区 该区整合于染色体的BL21 处。
• 2. 用途 • ① 体外： 体外： • 将这些RNA聚合酶特异性的启动子安 将这些 聚合酶特异性的启动子安 装在载体,如 装在载体 如pGEM-3Z载体 载体 (2.74kb,p13)中，用于体外转录（合 中 用于体外转录（ 与外源DNA同源的 同源的RNA， 成）与外源 同源的 ， • 从而用作杂交探针，体外翻译系统中 从而用作杂交探针， 的mRNA，体外剪接反应的底物 ， • 体外快速合成特异 体外快速合成特异RNA
• 若将 噬菌体启动子控制的目的基 若将T7噬菌体启动子控制的目的基 因 • 经质粒载体导入该宿主菌中 • 在IPTG(异丙基硫代 β-D-半乳糖苷 异丙基硫代-β 半乳糖苷 半乳糖苷) 异丙基硫代 诱导 • 启动外源基因的表达
一、来源
• 来源于噬菌体感染宿主后所产生
Байду номын сангаас
• SP6噬菌体聚合酶 噬菌体聚合酶 • 来源于感染鼠伤寒沙门氏菌 来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株 菌株 • • T3或T7噬菌体聚合酶 或 噬菌体聚合酶 • 来源于感染的大肠杆菌
二、活性与用途
• 这些 这些RNA聚合酶实际上为转录过程中 聚合酶实际上为转录过程中 RNA合成的酶，识别 合成的酶， 合成的酶 识别DNA中特异的启 中特异的启 动子序列，并沿此dsDNA模板起始 动子序列，并沿此 模板起始 RNA的合成 的合成。 的合成 • 与DNA聚合酶不同，无需引物，但识 聚合酶不同， 聚合酶不同 无需引物， 别特异性位点
• • •
② 体内：用于表达外源基因 体内： A. Ecoli 先构建宿主菌，将T7 poly RNA基因 先构建宿主菌， 基因 启动子之下，插入到λ 置于 lacUV5 启动子之下，插入到λ 噬菌体中，感染E.coli建立稳定的溶 噬菌体中，感染 建立稳定的溶 原菌 • Ecoli BL21(DE3)：lacUV5启动子 ： 启动子 +T7RNA聚合酶基因，置于λ噬菌体 聚合酶基因， 聚合酶基因 置于λ DE3区，该区整合于染色体的 区 该区整合于染色体的BL21 处。
• 2. 用途 • ① 体外： 体外： • 将这些RNA聚合酶特异性的启动子安 将这些 聚合酶特异性的启动子安 装在载体,如 装在载体 如pGEM-3Z载体 载体 (2.74kb,p13)中，用于体外转录（合 中 用于体外转录（ 与外源DNA同源的 同源的RNA， 成）与外源 同源的 ， • 从而用作杂交探针，体外翻译系统中 从而用作杂交探针， 的mRNA，体外剪接反应的底物 ， • 体外快速合成特异 体外快速合成特异RNA
• 若将 噬菌体启动子控制的目的基 若将T7噬菌体启动子控制的目的基 因 • 经质粒载体导入该宿主菌中 • 在IPTG(异丙基硫代 β-D-半乳糖苷 异丙基硫代-β 半乳糖苷 半乳糖苷) 异丙基硫代 诱导 • 启动外源基因的表达