基因工程制药ppt课件
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
基因工程制药教学
一、原核表达系统
二、酵母表达系统 三、昆虫细胞表达系统 四、哺乳动物细胞表达系统 五、转基因植物表达系统 六、转基因动物表达系统 七、表达系统的选择
2018/10/23
重组蛋白表达系统
重组蛋白表达系统有：
原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达 系统、哺乳动物表达系统、转基因植物表达系统和转 基因动物表达系统等。
2018/10/23
蛋白表达系统分类及优劣分析： 原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经 济实惠的蛋白表达系统。原核蛋白表达系统以大肠杆 菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表 达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主 要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、 蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的 几率较小。
2018/10/23
二、酵母表达系统
酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由
于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程 领域中得到日益广泛的应用，应用此系统可高水平表 达蛋白，且具有翻译后修饰功能，故被认可为一种表 达大规模蛋白的强有力的工具。
2018/10/23
常用的酵母表达系统：
一，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统：
酿酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在酿酒业和面 包业的使用已有数千年的历史，被认为是 GRAS(generally recognized as safe)生物，不产生 毒素，已被美国FDA确认为安全性生物，但酿酒 酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌 分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达 的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端 往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋 白质表达的宿主菌
2018/10/23
这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋
2018/10/23
二，甲醇营养型酵母表达系统：
甲醇酵母表达系 统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母 主要有汉森酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)， 球拟酵母属(Torulopsis)等，并以毕赤酵母属(Pichia) 应用最多。 甲醇酵母的表达载体为整合型质粒， 载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容 易整合入酵母染色体中，大部分甲醇酵母的表达载体 中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在该基因 的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。甲醇 酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。 再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。
Hale Waihona Puke Baidu
2018/10/23
酵母蛋白表达系统以甲醇毕赤酵母为代表，具有表 达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分 泌蛋白易纯化，易实现高密发酵等优点。缺点为部分 蛋白产物易降解，表达量不可控。
2018/10/23
哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统主要优点是蛋白翻
译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生 物活性，缺点是表达量通常较低，稳定细胞系建立技 术难度大，生产成本高。
2018/10/23
大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、
成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、 抗污染能力强以及适用范围广等。
2018/10/23
转录载体
翻译载体
2018/10/23
原核表达宿主菌的选择
BL21（DE3）：为 λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一
拷贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。 命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶 （为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质 粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿 主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞 生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。
2018/10/23
2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，
分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表 达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体 中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以 在宿主中表达。 3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入 宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆 状病毒。
2018/10/23
蛋白表达系统概述
蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成
分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿 主中表达的目的。一般由以下几个部分组成： 1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、 植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同， 适合表达蛋白的种类也不相同。
2018/10/23
一、原核表达系统
2018/10/23
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆
菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统，大 肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导 表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系 统。
2018/10/23
于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知
2018/10/23
Rosetta （DE3）： Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来，
可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。 该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译， 从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。
的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融 合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表 达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以 外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列 上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或 多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在 菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、 带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣 的表达载体。
一、原核表达系统
二、酵母表达系统 三、昆虫细胞表达系统 四、哺乳动物细胞表达系统 五、转基因植物表达系统 六、转基因动物表达系统 七、表达系统的选择
2018/10/23
重组蛋白表达系统
重组蛋白表达系统有：
原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达 系统、哺乳动物表达系统、转基因植物表达系统和转 基因动物表达系统等。
2018/10/23
蛋白表达系统分类及优劣分析： 原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经 济实惠的蛋白表达系统。原核蛋白表达系统以大肠杆 菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表 达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主 要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、 蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的 几率较小。
2018/10/23
二、酵母表达系统
酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由
于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程 领域中得到日益广泛的应用，应用此系统可高水平表 达蛋白，且具有翻译后修饰功能，故被认可为一种表 达大规模蛋白的强有力的工具。
2018/10/23
常用的酵母表达系统：
一，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统：
酿酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在酿酒业和面 包业的使用已有数千年的历史，被认为是 GRAS(generally recognized as safe)生物，不产生 毒素，已被美国FDA确认为安全性生物，但酿酒 酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌 分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达 的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端 往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋 白质表达的宿主菌
2018/10/23
这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋
2018/10/23
二，甲醇营养型酵母表达系统：
甲醇酵母表达系 统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母 主要有汉森酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)， 球拟酵母属(Torulopsis)等，并以毕赤酵母属(Pichia) 应用最多。 甲醇酵母的表达载体为整合型质粒， 载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容 易整合入酵母染色体中，大部分甲醇酵母的表达载体 中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在该基因 的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。甲醇 酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。 再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。
Hale Waihona Puke Baidu
2018/10/23
酵母蛋白表达系统以甲醇毕赤酵母为代表，具有表 达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分 泌蛋白易纯化，易实现高密发酵等优点。缺点为部分 蛋白产物易降解，表达量不可控。
2018/10/23
哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统主要优点是蛋白翻
译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生 物活性，缺点是表达量通常较低，稳定细胞系建立技 术难度大，生产成本高。
2018/10/23
大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、
成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、 抗污染能力强以及适用范围广等。
2018/10/23
转录载体
翻译载体
2018/10/23
原核表达宿主菌的选择
BL21（DE3）：为 λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一
拷贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。 命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶 （为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质 粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿 主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞 生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。
2018/10/23
2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，
分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表 达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体 中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以 在宿主中表达。 3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入 宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆 状病毒。
2018/10/23
蛋白表达系统概述
蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成
分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿 主中表达的目的。一般由以下几个部分组成： 1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、 植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同， 适合表达蛋白的种类也不相同。
2018/10/23
一、原核表达系统
2018/10/23
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆
菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统，大 肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导 表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系 统。
2018/10/23
于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知
2018/10/23
Rosetta （DE3）： Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来，
可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。 该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译， 从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。
的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融 合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表 达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以 外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列 上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或 多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在 菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、 带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣 的表达载体。