液相蛋白芯片技术

液相蛋白芯片技术

液相蛋白芯片技术由美国纳斯达克上市公司Luminex研制开发并于20世纪90年代中期发展起来，是在流式细胞技术、酶联免疫吸附试验(enzy me linked immunosorbent assay ，ELISA)技术和传统芯片技术基础上开发的新一代生物芯片技术和新型蛋白质研究平台。液相蛋白芯片技术推动了功能基因组时代的蛋白质研究，相关的仪器、分析软件以及试剂盒研发备受瞩目并已形成一定的市场规模。现拟对该技术的基本原理、技术特点及其在免疫诊断和分析领域的研究和应用情况进行综合介绍。

一、液相蛋白芯片技术的基本原理

传统的蛋白芯片技术是将蛋白质分子有序地固定在滤膜、滴定板和载玻片等固相载体上，用标记了特定荧光抗体的蛋白质等生物分子与芯片作用，再利用荧光或激光扫描技术测定其荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质的相互作用，从而达到研究蛋白质功能或免疫诊断的目的。但固相载体难于维持蛋白质的天然构象，不利于蛋白质功能研究。

液相芯片技术在国际上被称之为xMAP(flexible MultilyteProfili

ng)技术，其核心技术是乳胶微球包被、荧光编码以及液相分子杂交。液相芯片体系以聚苯乙烯微球(beads ) 为基质，微球悬浮于液相体系，每

种微球可根据不同研究目的标定上特定抗体或受体探针，可对同一样品中多个不同的分子同时进行检测。微球表面可进行一系列修饰以适合固定各

种蛋白、多肽或核酸等生物分子。xMAP技术可应用于蛋白或核酸的功能及其相互作用研究，分别称之为液相蛋白芯片技术和液相基因芯片技术。

液相蛋白芯片体系主要包括微球、蛋白探针分子、被检测物和报告分子四种成分。在液相系统中，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的微球都带有独特的色彩编码，其原理是在微球中掺入不同比例的红色分类荧光及发色剂，可产生100种颜色差别的微球，可标记上100种探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同目标分子进行检测。反应过程中, 探针和报告分子都分别与目标分子特异性结合。结合反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定所结合的检测物的种类和数量。二、液相蛋白芯片技术的特点

液相蛋白芯片技术有机地整合了微球、激光检测技术、流体动力学、高速的数字信号处理系统和计算机运算功能，不仅检测速度极快，而且在

免疫诊断以及蛋白质分子相互作用分析方面，其特异性和敏感性往往也超

越常规技术。其技术特点可归纳如下。

1、反应快速，灵敏度高。反应环境为液相、微球上固定的探针与待检样品均在溶液中反应，其彼此间碰撞几率与速度相对于固相芯片或EIISA等反应模式，可增加10倍以上，因此可提高反应速度及灵敏度。抗原---抗体

等蛋白质分子相互作用的结果可在瞬间经激光判定后由电脑以数据信息的形式记录下来，敏感性显着超越酶联信号或常规杂交信号检测。

2、通量大，可同时检测多种目标物，所需成本较低，减少人力消耗，可对

同一样品中多达100种分子同时进行分析。液相芯片系统采用96孔板为反应容器，在35〜60min内，可对96个不同的样品进行检测，所需样品用量比常规方法少。

3、可进行多元化分析，灵活性好，可适用于各种蛋白质分析，应用广泛。通过对微球表面的修饰，可固定各种抗体或受体分子，从而满足不同检测和功能的研究需要。

4、采用接近生物系统内部环境的完全液相反应体系，稳定性好。液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，不仅有利于探针和被检测物的反应，也更能保证反应的特异性和稳定性。

5、操作简便，不需洗涤，耗时短。常规ELISA或固相芯片技术，每一步反应之后都需充分洗涤以去除非特异结合成分，耗时且易造成污染。而液相

芯片技术可以避免这些过程和弊端。

三、液相蛋白芯片在免疫诊断和分析领域的应用

液相蛋白芯片系统适用于蛋白质组学研究，临床研究和药物研究中的

各种蛋白质分析，已被应用于细胞因子和激酶的检测、抗原决定簇的筛选、

多种蛋白质过敏原检测、传染病快速诊断以及与各种抗原、抗体反应相关的检测当中。在免疫诊断与分析研究应用方面，全球已有上百篇公开发表的论文和研究报道，主要可归纳为以下几方面。

1、传染病的快速检测和疾病诊断：XMAP夜相蛋白芯片免疫诊断方法又称为微球免疫方法(micro —sphereimmu no assay)，国内外已建立多种微球免疫方法用于人和动物传染病快速检测以及人类疾病诊断研究。

Yan等建立微球免疫检测方法进行流感病毒检测和分型，并与EusA方法比

较，结果表明微球免疫法对流感病毒粒子和重组血凝素抗原的检测敏感性均提高了10倍。Wong等建立微球免疫方法快速检测西尼罗病毒( WestNil evirus )，并能与登革热病毒感染、圣路易斯脑炎(St . Lousisencephali tis)病毒感染以及黄热病(flavivirus) 免疫鉴别开。Biagini等应用液相

蛋白芯片技术检测人群血样中抗炭疽IgG抗体，并与ELISA方法相比较，结果表明，前者更加敏感和快速，稳定性好，样品用量少，检测动力学范围广。Biagini等还建立液相蛋白芯片方法同时检测血清中23种血清型的肺炎球菌荚膜多糖抗体。Pickering等将微球免疫方法应用于检测破伤风(t etanus)、白喉(diphtheria) 以及B型嗜血性流感杆菌(haemophilusinflu enzatypeB)疫苗免疫抗体，并与ELISA方法相比较。对81份样品，两种方法对三种疫苗抗体的检测符合率可达91%- 96%而微球免疫方法能减少人

力和试剂消耗，并缩短检测时间。

在定量检测方面，国外也有报道。Dias等建立微球免疫方法，用于定量检测抗人乳头瘤病毒6、11、16和18型中和抗原的抗体，并根据检测结果确定用于临床诊断判定的抗体阈值。Lal等建立微球免疫检测方法，用于同时定量检测抗9种血清型肺炎链球菌的IgG抗体，研究表明，微球免疫液相蛋白芯片方法可用于肺炎链球菌疫苗免疫效果的评估。

此外，国外还有报道建立液相蛋白芯片方法用于检测艾滋病病毒抗体、疱疹病毒抗体、麻疹和腮腺炎抗体、弓形虫抗体、呼吸道合胞病毒抗体、类风湿因子等以及一种人类医学紊乱症---------- 乳糜泻(celiacdiseases) 的诊

断。

2、细胞因子检测与研究：应用液相蛋白芯片技术可对微量样品同时定量检测多种细胞因子。在人细胞因子的检测和研究方面，液相蛋白芯片技术的应用目前已有多篇报道。

Skogstrand等应用液相蛋白芯片技术同时检测新生儿干血点样品(dried b lood spot samples ，DBSS中25种细胞因子。新生儿炎症反应可能与脑瘫、自闭症和糖尿病等一些迟发的疾病有关，对新生儿进行炎症因子检测将有助于上述疾病的病原学研究。通常采用DBSS羊品进行检测，由于样品量少，采用常规免疫学方法对一份样品难以检测多种因子。而液相芯片方法可解决这个问题。实验表明，液相芯片方法对标准品的检测回收率平均可达10 5,批内和批间检测偏差分别为6. 2和16. 0。采用液相芯片对储存20年以上的样品进行检测，仍能检测到大多数细胞因子。研究表明，液相蛋白