医学保健基因操作的主要技术原理
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PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增
产物的数量满足实验需求为止。
Reaction Condition for a Typical PCR Assay
❖ PCR技术
在1983年,美国Cetus公司人类遗传研究 室的科学家K.B.Mullis发明的。
PCR是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA序列的方法,有称之为体外扩增法。
靶DNA的扩增
5’
3’
(a)
引物2 5’
(b)
3’
3’ 5’ 引物1
5’ (c) 引物2互补链
3’
3’ 引物1互补链
5’
(d)
kb
12
10 8
EtBr Detection Limit: ~5-10 ng DNA
6
4
2
1
根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小
Agarose gel electrophoresis
Agarose gel electrophoresis
❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳
❖ 缓冲液:TBE ❖ 凝胶聚丙烯酰胺:丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺
❖ 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和 构型。分子量较小的DNA分子,比分子量较大 的DNA分子迁移率要快;同等分子量的不同构 型的核酸分子,构型紧密的比松散型的开环 DNA分子或线性DNA分子迁移率要快
❖ 凝胶电泳的分辨力:
与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间
Parameter Concentration
Template pH dNTPs Gelatin Primers Mg2+ oncentration Enzyme Total volume
❖ 107bp的DNA大分子。
PFGE can resolve large DNA fragments
❖ 基因扩增(gene amplification)
主要内容: 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化,将目的基因在宿主细胞进
行扩增 3.在环境作用下,生物体内相关基因的扩增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增
(29:1);TEMED和过硫酸铵( 10％ )。
PolyAcrylamide Gels
❖ 脉冲电场凝胶电泳(PFGE)
❖ 1984年,D.R.Cantor发明的。分离超大分子量 的DNA分子。
❖ 在脉冲电泳中,电场方向是周期变化的,头一个脉冲电场方向 与核酸的移动方向成45 ℃角,下一个脉冲的电场方向与核酸 移动方向在另一侧成45 ℃角,由于加在琼脂糖凝胶电泳上的 电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着,这就 使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向,来适应凝胶孔隙 的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比,分子量大的 DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位,使之能够按 新的方向游动,所以迁移率就慢,从而达到了分离大分子量 DNA分子的目的。
精品PPT课件 浏览免费 下载后可以编辑修改。 http://www.docin.com/jn- l xh http://www.doc88.com/li aner2012 http://www.baidu. co m/ http://www.google.com/ http://www.sogou.com/
•琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的 线性多糖聚合物。
分为常熔点的琼脂糖和低熔点(LMP)琼 脂糖。
❖ LMP琼脂糖 熔点:62～65℃ 熔解后,在37℃ 可保持液态数小时; 在25℃ 可保持液态约10min
❖ 回收DNA分子 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化; 加入过量的酚抽提DNA; 离心获得含DNA分子的上清液;
3’
5’
新引物
5’
3’
(e) 不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’
3’
(g)
3’
引物1互补链
5’
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
温度（℃）
94
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
72 72 ℃延伸
60
60 ℃退火 （1.5min）
（1min）
循环3
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
❖ 直接酶切
❖ 琼脂糖凝胶电泳的参数:
缓冲液:1× TAE(TBE TPE) 凝胶的含量:根据检测的DNA大小 加DNA样品:<1μg,指示剂 电泳条件:大片断低电压长时间,小片段高电压短时 间
染色和观察:溴化乙锭(ethidium bromide,EB)染色, 在300nm波长的紫外下观察(凝胶成像仪)。 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比
❖ 在脉冲电泳中,电场方向是周期变化的,头一个脉冲 电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角,下一个脉冲 的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角,由 于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、 以及作用时间都在交替地变换着,这就使得DNA分子 必须随时调整其泳动的方向,来适应凝胶孔隙的无规 则变化。 与分子量小的DNA分子相比,分子量大的 DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位,使之 能够按新的方向游动,所以迁移率就慢,从而达到了 分离大分子量DNA分子的目的。
基因操作的主要技术原理
❖ 核酸的凝胶电泳
❖ 扩增原理 ❖ 分子杂交 ❖ 测序
•核酸的凝胶电泳
它是一种分析鉴定重组DNA分子及 蛋白质与核酸相互作用的重要实验手 段,同时也是分子生物学研究方法的技 术基础。
❖ 基本原理
带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链,依靠 无反应活性的稳定的介质(琼脂糖凝胶和聚丙 烯酰胺凝胶)和缓冲液,在电场中以一定的迁 移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不 同、构型或形状的差异,以及所带电荷的不同, 可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此 分开。
SΒιβλιοθήκη Baiduparation Range Vs. ﹪ Agarose
Low Geling Agarose 4-6
0.02-0.4
用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算
Sample Well
25 ng 1 kb ladder 0.8﹪ Agarose
Agarose Gel Electrophoresis
产物的数量满足实验需求为止。
Reaction Condition for a Typical PCR Assay
❖ PCR技术
在1983年,美国Cetus公司人类遗传研究 室的科学家K.B.Mullis发明的。
PCR是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA序列的方法,有称之为体外扩增法。
靶DNA的扩增
5’
3’
(a)
引物2 5’
(b)
3’
3’ 5’ 引物1
5’ (c) 引物2互补链
3’
3’ 引物1互补链
5’
(d)
kb
12
10 8
EtBr Detection Limit: ~5-10 ng DNA
6
4
2
1
根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小
Agarose gel electrophoresis
Agarose gel electrophoresis
❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳
❖ 缓冲液:TBE ❖ 凝胶聚丙烯酰胺:丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺
❖ 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和 构型。分子量较小的DNA分子,比分子量较大 的DNA分子迁移率要快;同等分子量的不同构 型的核酸分子,构型紧密的比松散型的开环 DNA分子或线性DNA分子迁移率要快
❖ 凝胶电泳的分辨力:
与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间
Parameter Concentration
Template pH dNTPs Gelatin Primers Mg2+ oncentration Enzyme Total volume
❖ 107bp的DNA大分子。
PFGE can resolve large DNA fragments
❖ 基因扩增(gene amplification)
主要内容: 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化,将目的基因在宿主细胞进
行扩增 3.在环境作用下,生物体内相关基因的扩增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增
(29:1);TEMED和过硫酸铵( 10％ )。
PolyAcrylamide Gels
❖ 脉冲电场凝胶电泳(PFGE)
❖ 1984年,D.R.Cantor发明的。分离超大分子量 的DNA分子。
❖ 在脉冲电泳中,电场方向是周期变化的,头一个脉冲电场方向 与核酸的移动方向成45 ℃角,下一个脉冲的电场方向与核酸 移动方向在另一侧成45 ℃角,由于加在琼脂糖凝胶电泳上的 电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着,这就 使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向,来适应凝胶孔隙 的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比,分子量大的 DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位,使之能够按 新的方向游动,所以迁移率就慢,从而达到了分离大分子量 DNA分子的目的。
精品PPT课件 浏览免费 下载后可以编辑修改。 http://www.docin.com/jn- l xh http://www.doc88.com/li aner2012 http://www.baidu. co m/ http://www.google.com/ http://www.sogou.com/
•琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的 线性多糖聚合物。
分为常熔点的琼脂糖和低熔点(LMP)琼 脂糖。
❖ LMP琼脂糖 熔点:62～65℃ 熔解后,在37℃ 可保持液态数小时; 在25℃ 可保持液态约10min
❖ 回收DNA分子 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化; 加入过量的酚抽提DNA; 离心获得含DNA分子的上清液;
3’
5’
新引物
5’
3’
(e) 不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’
3’
(g)
3’
引物1互补链
5’
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
温度（℃）
94
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
72 72 ℃延伸
60
60 ℃退火 （1.5min）
（1min）
循环3
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
❖ 直接酶切
❖ 琼脂糖凝胶电泳的参数:
缓冲液:1× TAE(TBE TPE) 凝胶的含量:根据检测的DNA大小 加DNA样品:<1μg,指示剂 电泳条件:大片断低电压长时间,小片段高电压短时 间
染色和观察:溴化乙锭(ethidium bromide,EB)染色, 在300nm波长的紫外下观察(凝胶成像仪)。 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比
❖ 在脉冲电泳中,电场方向是周期变化的,头一个脉冲 电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角,下一个脉冲 的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角,由 于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、 以及作用时间都在交替地变换着,这就使得DNA分子 必须随时调整其泳动的方向,来适应凝胶孔隙的无规 则变化。 与分子量小的DNA分子相比,分子量大的 DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位,使之 能够按新的方向游动,所以迁移率就慢,从而达到了 分离大分子量DNA分子的目的。
基因操作的主要技术原理
❖ 核酸的凝胶电泳
❖ 扩增原理 ❖ 分子杂交 ❖ 测序
•核酸的凝胶电泳
它是一种分析鉴定重组DNA分子及 蛋白质与核酸相互作用的重要实验手 段,同时也是分子生物学研究方法的技 术基础。
❖ 基本原理
带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链,依靠 无反应活性的稳定的介质(琼脂糖凝胶和聚丙 烯酰胺凝胶)和缓冲液,在电场中以一定的迁 移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不 同、构型或形状的差异,以及所带电荷的不同, 可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此 分开。
SΒιβλιοθήκη Baiduparation Range Vs. ﹪ Agarose
Low Geling Agarose 4-6
0.02-0.4
用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算
Sample Well
25 ng 1 kb ladder 0.8﹪ Agarose
Agarose Gel Electrophoresis