CFW荧光染色法检测疑似真菌感染的临床应用评价
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采集每例患者3份适量样本，分别用于KOH湿 片镜检法、CFW荧光染色法、真菌培养法检测。 1.3.1 KOH湿片镜检法 取适量临床样本置于 载玻片上，加1滴KOH溶液，盖上盖玻片。放置 片刻或在酒精灯火焰上微加热，即在酒精灯火 焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结 晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡、压薄样本。 先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高 倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大 小和排列方式等。 1.3.2 CFW荧光染色法 将载有临床样本的 载玻片放置在水平操作台上，直接向样本上滴 加1滴溶液A，静置1 min，如样本的角质化程 度较高，需静置2 min，可适当加热，以不沸 腾为度。 滴加溶液B 1滴，静置1 min。 盖上 盖玻片，轻轻压盖玻片，用棉签吸去多余的 染色剂。将样本置于CX23荧光显微镜（日本 Olympus公司）下观察：先用低倍镜找到样本所 在位置，再用高倍镜寻找菌丝或孢子等结构加 以证实。 1.3.3 真菌培养与鉴定 将临床样本分别接种于 含有50 μg/mL氯霉素的SDA和含有500 μg/mL放 线菌酮的SDA上，置26 ℃培养箱培养2～3周。 丝状真菌通过菌落特征和显微镜下特征鉴定， 念珠菌通过转种科马嘉念珠菌显色培养基或用 API20CAUX测试板条鉴定。 1.4 统计学方法
荧光染色剂CFW购自石家庄博洋生物科技 有限公司（批号20160613）。溶液A主要由荧光 增白剂、氢氧化钾和水组成，高浓度的荧光素
基金项目：上海市卫生和计划生育委员会面上项目（20140388） 作者简介：何文婧，女，1990年生，学士，技师，主要从事真菌学检验、菌种鉴定及药物敏感性分析研究。 通信作者：杨连娟，联系电话：021-61833000-3600。
CFW 荧光染色法检测疑似真菌感染的临床应用评价
何文婧， 高志琴， 陈 健， 任弘谨， 杨 虹， 蔡 晴， 杨连娟 （上海市皮肤病医院，上海 200050）
摘要：目的 探讨荧光染色剂Calcofluor White（CFW）在真菌感染诊断中的临床应用价值，并与传统KOH 湿片镜检法及真菌培养法进行比较，寻找更有效的真菌检测方法。方法 选取临床155例疑似真菌感染的患 者，采用KOH湿片镜检法、CFW荧光染色法和真菌培养法进行检测。结果 CFW荧光染色法阳性率（85.8%） 最高，KOH湿片镜检法阳性率（76.1%）次之，二者差异有统计学意义（χ2 =14.45，P<0.05），真菌培养法阳 性率（71.0%）最低。结论 CFW荧光染色法可显著提高真菌检测的阳性率，是一种有效的真菌检测方法。
检验医学 2018 年 4 月第 33 卷第 4 期 Laboratory Medicine，April 2018，Vol. 33，No. 4
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文章编号 ：1673-8640（2018）04-0331-04 中图分类号 ：R446.1 文献标志码 ：A DOI ：10.3969/j.issn.1673-8640.2018.04.013
图5 头癣荧光染色镜下形态
注：足部皮屑，荧光染色镜检可见细长有隔菌丝（×400） 图3 足癣荧光染色镜下形态
注：面部，荧光染色（×400） 图6 毛囊虫荧光染色镜下形态
3 讨论 浅部真菌感染的诊断主要依赖于临床样本
的真菌直接镜检和培养[3]。在传统真菌感染的 诊断中，KOH湿片镜检法是最简单、最经济的
表1 不同疾病患者3种方法的真菌检测结果 [例（%）]
CWF荧光染 KOH湿片镜 真菌培养法
疾病类型 例数
色法阳性 检法阳性
阳性
手足癣
46 36（78.3） 33（71.7） 33（71.7）
体股癣
60 52（86.7） 53（88.3） 49（81.7）
脂溢性皮炎 5 5（100.0） 0（0.0） 0（0.0）
图1～6。
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注：趾甲皮屑，荧光染色镜检可见大量有隔菌丝（×400） 图1 甲癣荧光染色镜下形态
注：手臂皮脂腺，荧光染色镜检可见大量出芽孢子（×400） 图4 毛囊炎荧光染色镜下形态
注：胸部皮屑，荧光染色镜检可见大量孢子和弧状菌丝 （×400）
图2 花斑糠疹荧光染色镜下形态
注：头发，荧光染色镜检可见大量发内菌丝，大多纵向分 布（×400）
合计
155 133（85.8） 118（76.1） 110（71.0）
2.2 不同菌种CFW荧光染色法与KOH湿片镜检 法阳性率比较
对155例患者皮屑进行真菌培养，其中107 例真菌培养阳性并做真菌菌种鉴定。对比不同 菌种KOH湿片镜检法与CFW荧光染色法的阳性 率，发现2种方法检测皮肤癣菌与非皮肤癣菌真 菌的阳性率差异不大，而CFW荧光染色法对酵 母的阳性率明显高于KOH湿片镜检法。见表2。
1 材料和方法 1.1 研究对象
选取上海市皮肤病医院门诊疑似真菌感 染患者共155例，其中男79例、女76例，年龄 （42.0±17.6）岁。采集腹股沟、指（趾）甲、 头、手、足、胸、龟头包皮等部位的样本和白 带等。每例样本分别采用KOH湿片镜检法、 CFW荧光染色法和真菌培养法检测。在进行真 菌培养时，每例样本接种于2管沙氏葡萄糖蛋白 胨琼脂培养基（sabouraud dextrose agar，SDA） 上，26 ℃培养2～3周。 1.2 试剂
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检验医学 2018 年 4 月第 33 卷第 4 期 Laboratory Medicine，April 2018，Vol. 33，No. 4
与真菌细胞壁的主要成分几丁质相结合，标记 荧光。溶液B为复染剂，由伊文思蓝和水组成， 复染剂可降低样本组织的背景亮度，增加对比 度，使荧光信号更加清晰。10%/20%KOH溶液 由KOH和水配制而成。指（趾）甲或角质层 较厚的皮屑用20%KOH溶液溶解，其他样本用 10%KOH溶液溶解。KOH能溶解临床样本中的 角质，使组织透明。 1.3 方法
采用SPSS 11.0软件进行统计分析。采用χ2检 验比较CFW荧光染色法与KOH湿片镜检法的检 测结果，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 3种方式对不同疾病患者样本的检测结果
155例患者不同部位样本的真菌检测结果显 示，CFW荧光染色法阳性率（85.8%）最高， KOH湿片镜检法阳性率（76.1%）次之，二者
Key words：Fluorescent dye Calcofluor White；KOH；Fungal culturing
荧光染色剂Calcofluor White（CFW）能与 真菌细胞壁的纤维素、几丁质和其他含β-1，4糖苷键的碳水化合物紧密结合[1]，可吸收紫外 光，使菌丝和孢子发出明亮的荧光，在荧光显 微镜下真菌轮廓与黑暗的背景对比明显。国外 实验室早已将荧光显微镜用于真菌性角膜炎等 疾病病原真菌的检测[2]，而国内实验室由于早 年缺乏荧光显微镜，一直沿用KOH湿片镜检法 加真菌培养法来检测真菌。但真菌培养及形态 学检测耗时长，传统KOH湿片镜检法假阳性率 高，使这2种方法均不能满足临床需要。本研 究对疑似真菌感染患者的临床样本同时进行了 KOH湿片镜检法、CFW荧光染色法和真菌培养 法检测，以评价CFW荧光染色统计学意义（χ2=14.45，P<0.05）。真 菌培养法阳性率（71.0%）最低。其中，脂溢 性皮炎、生殖器念珠菌病、马拉色菌性毛囊炎 等患者的皮屑在镜下可见少量或大量孢子， CFW荧光染色法对孢子镜检的阳性率明显高于 KOH湿片镜检法；对于手足癣、体股癣和头癣 患者，CFW荧光染色法与KOH湿片镜检法阳 性率相当；CFW荧光染色法对甲真菌病患者检 测的阳性率（100.0%）稍高于KOH湿片镜检法 （89.5%）。见表1。
头癣
2 2（100.0） 2（100.0） 2（100.0）
甲真菌病 19 19（100.0） 17（89.5） 12（63.2）
生殖器念珠 8 5（62.5） 3（37.5） 5（62.5） 菌病
马拉色菌性 12 11（91.7） 7（58.3） 7（58.3） 毛囊炎
花斑糠疹
3 3（100.0） 3（100.0） 2（66.7）
非皮肤癣菌真菌 20 20（100.0） 20（100.0）
合计
110 104（94.5） 98（89.0）
检验医学 2018 年 4 月第 33 卷第 4 期 Laboratory Medicine，April 2018，Vol. 33，No. 4
2.3 不同感染部位样本的荧光染色镜下形态 不同感染部位样本的荧光染色镜下形态见
表2 不同菌种CFW荧光染色法与KOH湿片镜检法
阳性率的比较
[例（%）]
菌种
例数 CFW荧光染 KOH湿片镜 色法阳性 检法阳性
皮肤癣菌
61 57（93.4） 58（95.1）
念珠菌
17 15（88.2） 12（70.6）
马拉色菌
9 9（100.0） 6（66.7）
红酵母
3 3（100.0） 2（66.7）
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检验医学 2018 年 4 月第 33 卷第 4 期 Laboratory Medicine，April 2018，Vol. 33，No. 4
方法，但该法的准确检测需要有经验的检验工 作者，降低把细胞壁、纤维误认为菌丝[4-5]，把 气泡和油滴误认为孢子的概率才能实现。真菌 培养结果与皮屑采集的质量、数量及患者的近 期用药情况均息息相关，且耗时长。在本研究 中，真菌培养法在真菌性疾病的诊断中阳性率 最低。真菌荧光染色剂CFW为二苯乙烯类化合 物，是一种非特异性荧光染料，能够非特异性 地结合β-1，3-糖苷键和β-1，4-糖苷键连接的多 糖，如几丁质、葡萄糖、纤维素。在荧光显微 镜下，发散光和激发光波长在355 nm时，真菌 发出明亮的蓝色荧光，而其他成分呈微弱的灰 蓝色，是能快速检测真菌的新型染色剂，适用 于各种疑似真菌感染的检查，如体股癣、手足 癣、头癣、甲癣和花斑糠疹等，也可与各类真 菌结合而发出荧光，包括毛癣菌、念珠菌、马 拉色菌及曲霉等。本研究在CFW荧光染色法真 菌镜检过程中偶见明显的毛囊虫虫体（图6）， 与周围背景形成鲜明对此，虫体形态结构清 晰，由此可见CFW荧光染色法也可用于临床毛 囊虫的检查。
关键词：荧光染色剂Calcofluor White；KOH；真菌培养
CFW fluorescent staining in detecting suspected fungal infection HE Wenjing，GAO Zhiqin，CHEN Jian，REN Hongjin，YANG Hong，CAI Qing，YANG Lianjuan. （Shanghai Dermatology Hospital，Shanghai 200050，China）
Abstract：Objective To investigate the role of fluorescent dye Calcofluor White（CFW） in the diagnosis of fungal infection，and to compare with KOH microscopic examination and fungal culturing，so as to find an effective method for detecting fungi. Methods A total of 150 clinically suspected patients with fungal infection were enrolled， and the samples were detected by CFW，KOH microscopic examination and fungal culturing. Results The positive rate of CFW was 85.8%，the positive rate of KOH microscopic examination and fungal culturing were 76.1% and 71.0%， respectively. There was statistical significance between CFW and KOH microscopic examination（χ2=14.45，P<0.05）. Conclusions CFW could improve positive rate，and it is an effective method for detecting fungi.
荧光染色剂CFW购自石家庄博洋生物科技 有限公司（批号20160613）。溶液A主要由荧光 增白剂、氢氧化钾和水组成，高浓度的荧光素
基金项目：上海市卫生和计划生育委员会面上项目（20140388） 作者简介：何文婧，女，1990年生，学士，技师，主要从事真菌学检验、菌种鉴定及药物敏感性分析研究。 通信作者：杨连娟，联系电话：021-61833000-3600。
CFW 荧光染色法检测疑似真菌感染的临床应用评价
何文婧， 高志琴， 陈 健， 任弘谨， 杨 虹， 蔡 晴， 杨连娟 （上海市皮肤病医院，上海 200050）
摘要：目的 探讨荧光染色剂Calcofluor White（CFW）在真菌感染诊断中的临床应用价值，并与传统KOH 湿片镜检法及真菌培养法进行比较，寻找更有效的真菌检测方法。方法 选取临床155例疑似真菌感染的患 者，采用KOH湿片镜检法、CFW荧光染色法和真菌培养法进行检测。结果 CFW荧光染色法阳性率（85.8%） 最高，KOH湿片镜检法阳性率（76.1%）次之，二者差异有统计学意义（χ2 =14.45，P<0.05），真菌培养法阳 性率（71.0%）最低。结论 CFW荧光染色法可显著提高真菌检测的阳性率，是一种有效的真菌检测方法。
检验医学 2018 年 4 月第 33 卷第 4 期 Laboratory Medicine，April 2018，Vol. 33，No. 4
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文章编号 ：1673-8640（2018）04-0331-04 中图分类号 ：R446.1 文献标志码 ：A DOI ：10.3969/j.issn.1673-8640.2018.04.013
图5 头癣荧光染色镜下形态
注：足部皮屑，荧光染色镜检可见细长有隔菌丝（×400） 图3 足癣荧光染色镜下形态
注：面部，荧光染色（×400） 图6 毛囊虫荧光染色镜下形态
3 讨论 浅部真菌感染的诊断主要依赖于临床样本
的真菌直接镜检和培养[3]。在传统真菌感染的 诊断中，KOH湿片镜检法是最简单、最经济的
表1 不同疾病患者3种方法的真菌检测结果 [例（%）]
CWF荧光染 KOH湿片镜 真菌培养法
疾病类型 例数
色法阳性 检法阳性
阳性
手足癣
46 36（78.3） 33（71.7） 33（71.7）
体股癣
60 52（86.7） 53（88.3） 49（81.7）
脂溢性皮炎 5 5（100.0） 0（0.0） 0（0.0）
图1～6。
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注：趾甲皮屑，荧光染色镜检可见大量有隔菌丝（×400） 图1 甲癣荧光染色镜下形态
注：手臂皮脂腺，荧光染色镜检可见大量出芽孢子（×400） 图4 毛囊炎荧光染色镜下形态
注：胸部皮屑，荧光染色镜检可见大量孢子和弧状菌丝 （×400）
图2 花斑糠疹荧光染色镜下形态
注：头发，荧光染色镜检可见大量发内菌丝，大多纵向分 布（×400）
合计
155 133（85.8） 118（76.1） 110（71.0）
2.2 不同菌种CFW荧光染色法与KOH湿片镜检 法阳性率比较
对155例患者皮屑进行真菌培养，其中107 例真菌培养阳性并做真菌菌种鉴定。对比不同 菌种KOH湿片镜检法与CFW荧光染色法的阳性 率，发现2种方法检测皮肤癣菌与非皮肤癣菌真 菌的阳性率差异不大，而CFW荧光染色法对酵 母的阳性率明显高于KOH湿片镜检法。见表2。
1 材料和方法 1.1 研究对象
选取上海市皮肤病医院门诊疑似真菌感 染患者共155例，其中男79例、女76例，年龄 （42.0±17.6）岁。采集腹股沟、指（趾）甲、 头、手、足、胸、龟头包皮等部位的样本和白 带等。每例样本分别采用KOH湿片镜检法、 CFW荧光染色法和真菌培养法检测。在进行真 菌培养时，每例样本接种于2管沙氏葡萄糖蛋白 胨琼脂培养基（sabouraud dextrose agar，SDA） 上，26 ℃培养2～3周。 1.2 试剂
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与真菌细胞壁的主要成分几丁质相结合，标记 荧光。溶液B为复染剂，由伊文思蓝和水组成， 复染剂可降低样本组织的背景亮度，增加对比 度，使荧光信号更加清晰。10%/20%KOH溶液 由KOH和水配制而成。指（趾）甲或角质层 较厚的皮屑用20%KOH溶液溶解，其他样本用 10%KOH溶液溶解。KOH能溶解临床样本中的 角质，使组织透明。 1.3 方法
采用SPSS 11.0软件进行统计分析。采用χ2检 验比较CFW荧光染色法与KOH湿片镜检法的检 测结果，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 3种方式对不同疾病患者样本的检测结果
155例患者不同部位样本的真菌检测结果显 示，CFW荧光染色法阳性率（85.8%）最高， KOH湿片镜检法阳性率（76.1%）次之，二者
Key words：Fluorescent dye Calcofluor White；KOH；Fungal culturing
荧光染色剂Calcofluor White（CFW）能与 真菌细胞壁的纤维素、几丁质和其他含β-1，4糖苷键的碳水化合物紧密结合[1]，可吸收紫外 光，使菌丝和孢子发出明亮的荧光，在荧光显 微镜下真菌轮廓与黑暗的背景对比明显。国外 实验室早已将荧光显微镜用于真菌性角膜炎等 疾病病原真菌的检测[2]，而国内实验室由于早 年缺乏荧光显微镜，一直沿用KOH湿片镜检法 加真菌培养法来检测真菌。但真菌培养及形态 学检测耗时长，传统KOH湿片镜检法假阳性率 高，使这2种方法均不能满足临床需要。本研 究对疑似真菌感染患者的临床样本同时进行了 KOH湿片镜检法、CFW荧光染色法和真菌培养 法检测，以评价CFW荧光染色统计学意义（χ2=14.45，P<0.05）。真 菌培养法阳性率（71.0%）最低。其中，脂溢 性皮炎、生殖器念珠菌病、马拉色菌性毛囊炎 等患者的皮屑在镜下可见少量或大量孢子， CFW荧光染色法对孢子镜检的阳性率明显高于 KOH湿片镜检法；对于手足癣、体股癣和头癣 患者，CFW荧光染色法与KOH湿片镜检法阳 性率相当；CFW荧光染色法对甲真菌病患者检 测的阳性率（100.0%）稍高于KOH湿片镜检法 （89.5%）。见表1。
头癣
2 2（100.0） 2（100.0） 2（100.0）
甲真菌病 19 19（100.0） 17（89.5） 12（63.2）
生殖器念珠 8 5（62.5） 3（37.5） 5（62.5） 菌病
马拉色菌性 12 11（91.7） 7（58.3） 7（58.3） 毛囊炎
花斑糠疹
3 3（100.0） 3（100.0） 2（66.7）
非皮肤癣菌真菌 20 20（100.0） 20（100.0）
合计
110 104（94.5） 98（89.0）
检验医学 2018 年 4 月第 33 卷第 4 期 Laboratory Medicine，April 2018，Vol. 33，No. 4
2.3 不同感染部位样本的荧光染色镜下形态 不同感染部位样本的荧光染色镜下形态见
表2 不同菌种CFW荧光染色法与KOH湿片镜检法
阳性率的比较
[例（%）]
菌种
例数 CFW荧光染 KOH湿片镜 色法阳性 检法阳性
皮肤癣菌
61 57（93.4） 58（95.1）
念珠菌
17 15（88.2） 12（70.6）
马拉色菌
9 9（100.0） 6（66.7）
红酵母
3 3（100.0） 2（66.7）
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检验医学 2018 年 4 月第 33 卷第 4 期 Laboratory Medicine，April 2018，Vol. 33，No. 4
方法，但该法的准确检测需要有经验的检验工 作者，降低把细胞壁、纤维误认为菌丝[4-5]，把 气泡和油滴误认为孢子的概率才能实现。真菌 培养结果与皮屑采集的质量、数量及患者的近 期用药情况均息息相关，且耗时长。在本研究 中，真菌培养法在真菌性疾病的诊断中阳性率 最低。真菌荧光染色剂CFW为二苯乙烯类化合 物，是一种非特异性荧光染料，能够非特异性 地结合β-1，3-糖苷键和β-1，4-糖苷键连接的多 糖，如几丁质、葡萄糖、纤维素。在荧光显微 镜下，发散光和激发光波长在355 nm时，真菌 发出明亮的蓝色荧光，而其他成分呈微弱的灰 蓝色，是能快速检测真菌的新型染色剂，适用 于各种疑似真菌感染的检查，如体股癣、手足 癣、头癣、甲癣和花斑糠疹等，也可与各类真 菌结合而发出荧光，包括毛癣菌、念珠菌、马 拉色菌及曲霉等。本研究在CFW荧光染色法真 菌镜检过程中偶见明显的毛囊虫虫体（图6）， 与周围背景形成鲜明对此，虫体形态结构清 晰，由此可见CFW荧光染色法也可用于临床毛 囊虫的检查。
关键词：荧光染色剂Calcofluor White；KOH；真菌培养
CFW fluorescent staining in detecting suspected fungal infection HE Wenjing，GAO Zhiqin，CHEN Jian，REN Hongjin，YANG Hong，CAI Qing，YANG Lianjuan. （Shanghai Dermatology Hospital，Shanghai 200050，China）
Abstract：Objective To investigate the role of fluorescent dye Calcofluor White（CFW） in the diagnosis of fungal infection，and to compare with KOH microscopic examination and fungal culturing，so as to find an effective method for detecting fungi. Methods A total of 150 clinically suspected patients with fungal infection were enrolled， and the samples were detected by CFW，KOH microscopic examination and fungal culturing. Results The positive rate of CFW was 85.8%，the positive rate of KOH microscopic examination and fungal culturing were 76.1% and 71.0%， respectively. There was statistical significance between CFW and KOH microscopic examination（χ2=14.45，P<0.05）. Conclusions CFW could improve positive rate，and it is an effective method for detecting fungi.