单精子卵胞浆内注射操作常规

单精子卵胞浆内注射(ICSI)操作常规

显微操作糸统

显微操作系统是由NIKON-TE2000倒置显微镜、NARISHIGE显微操作系统、Eppendorf液压显微注射臂和NARISHIGE气压持卵臂组成。

显微操作系统配备恒温台，其设置温度应使ICSI注射器中的液滴保持37℃。

显微注射针和持卵针内的压力由操作器控制，显微注射臂连接的管中充满矿物油．使整个管路中不含空气，持卵臂连接的管中为空气。

显微注射针

ICSI显微注射针对于成功的ICSI是非常重要的，采用的是Origio公司生产的Humagen ICSI针和Holding针。

精子处理

1. 将Isolate“upper”和“lower”和sperm washing medium平衡至室温。

2. 制备梯度：在离心管中各加入1.5 ml -2.0 ml“upper”和“lower”，“upper”在上，“lower”在下，注意加样时动作轻柔，避免产生气泡及将二者充分混匀，两者之间应形成明显的界面。在制好的密度梯度上加1.5 ml -2.0 ml的液化的精液。

3. 离心300g×15min。

4. 弃上清液，用吸管将离心管底层的白色沉淀转移至另一支含2 ml -3 ml sperm washing medium的离心管中，转移沉淀时应避免过多地将洗液吸上来，同时还要保证能尽量多地吸取沉淀。

5. 离心200g×10min。

6. 弃上清液，留沉淀0.3ml-0.5 ml备用，同时取样镜检。

卵细胞准备，颗粒细胞（放射冠）去除（拆蛋）：

1. 选用透明质酸酶和PVP均为商品化试剂，提前预温，透明质酸酶需在使用前1小时放置于二氧化碳培养箱中平衡。

2. 拉制口径200～300μm毛细管数根。准备两个3037皿，分别标上ICSI前和ICSI后以及患者姓名和日期。两个3037皿中间均加入1ml G1并覆盖矿物油，移入培养箱备用。

3. 在已预热的4孔板1、2和3号孔、中间孔中加入G-MOPS液各1ml。在1号孔中加入透明质酸酶工作液3μl。4号孔中加入G1液1ml。

4. 每次取COCs 4～5枚加入4孔板的1号孔，用较大口径毛细管反复吹打至去除大部分卵丘颗粒细胞，20秒内移入中间孔洗涤，再到2号孔用200μm毛细管继续吹打至颗粒细胞基本去除，15秒内再移入3号孔吹打洗涤至完全去除颗粒细胞。将卵母细胞在4号孔中充分洗涤后移入ICSI前的3037皿中，随后移入培养箱中备用。

显微注射准备：

1. PVP：提前预温

2. 显微注射皿的准备：采用1006皿制备显微注射皿

3. 架针：调节附有显微注射器的倒置显微镜，先在普通4倍镜下调焦，清晰后换至高4倍镜安装显微固定针及显微注射针，调节平行，特别注意调节显微注射针的水平位置。安好后再依次换至普通4倍至20倍，检查注射针尖端是否锐利，固定针顶端是否光滑，两针分别吸入少量培养液平衡压力。

精子选择、制动与卵浆内注射：

1. 尽可能选择形态正常与活动好的精子，将此类精子移入PVP滴。

2. 注射针置于精子尾部中点，下压、水平快速拉过尾部制动，将精子从尾部吸入注射刺针。

3. 取1枚或多枚（最多不能超过4枚）成熟卵移入ICSI皿的G-MOPS培养液滴中，用固定针于9点处将1只卵固定，极体置于6或12点处。

4. 将已吸入一条经制动处理精子的注射针移入液滴（如发现精子仍活动，则须返回PVP滴重新制动），检查推拉注射器（或吹吸）时精子是否前后移动（未粘于注射针内壁），于3点或9点处刺入透明带、卵细胞膜，回吸部分卵胞浆（胞浆如能快速回吸入注射针，则说明胞膜已破），然后将回吸的胞浆连同精子及尽量少的PVP一起注入胞浆，慢慢撤出注射针。注射后卵细胞浆在1～5分钟内缓慢恢复正常形态，这时检查精子是否留在胞浆内，如果精子被注射到卵周间隙，则需要重复注射一次。如一次移入几只卵，则重复上述步骤至注射完所有卵细胞。每个G-MOPS滴只允许用一次。

5. 将已注射的卵移入标有ICSI后的3037皿中反复洗涤，移入G1培养滴中，采用单滴单卵法进行培养，培养皿迅速置于37℃，5%CO2培养箱培养。

6. 根据受精后第二天有无两个原核(2PN)及两个极体出现来判断是否受精。

7. 无极体的未成熟卵可尝试继续培养，待当晚或第二天出现第一极体后再行精子注射。