生物分离技术笔记
生物分离技术
一、概述
1、生物分离技术的基础：生物化学、微生物学、动物、植物细胞工程。
生物分离技术的定位：下游——分离、纯化。（上游：选菌、DNA重组、蛋白质改造；中游：发酵、表达、固化技术）在传统发酵投资中占60%，在DNA和蛋白质精制中占80-90%。
2、发展历史：第一阶段：1950年以前的纯培养技术，以压滤、蒸馏为主。
第二阶段：1950通气培养技术和代谢控制技术（离子交换和电泳）
第三阶段：21世纪，现代生物技术；生物分离工程。
3、分离技术及应用范围：
?沉淀分离：盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性沉淀、非离子聚合物沉淀（PEP）?层析分离：吸附、凝胶、离子交换、疏水、反相、层析、聚焦层析和亲和等
?电泳分离：SDS-PAGE、等电聚焦、2D-电泳、毛细管电泳
?离心分离：低速、高速、超速
?膜分离：透析、微滤、超滤、纳滤、反渗透
?萃取技术（双水相萃取、超临界流体萃取、反胶束萃取）、液膜分离、泡沫分离、结晶技术等。
4、生化分离技术的特点：成分复杂、含量极微、易变性、易破坏、具有经验性和均一性；
易变性主要体现在过酸、过碱、高温、高压、离子强度和重金属离子，较低的温度和洁净的环境才下进行。生化分离方法多采用温和“多阶式”进行，“多层剥皮”的方法，现在有一种新技术“钓鱼法”，利用的是某些分子的特有的专一亲和
．．力。
易破坏：氧化、水解、微生物污染。
由于品种多、难度大，导致成本高，所以需要考虑：产品价格；质量标准；产品与杂质的物化区别；产品流经途径是否合理；不同的分离技术方案经济指标的比较。
主要原理是用机械方法或者混合物外加一定的作用力，使各组分分配到不同的物相中。
5、生化分离的基本步骤：
1）建立分析方法：生化分离过程一旦展开，都应首先建立快速灵敏的分析方法，以保证分离工作的顺利进行，利用生物测定、理化测定或两者的结合。测定方法必须满足特异性、重现性好、准确度高、灵敏度高、时间短。
2）选择提取材料：原则是材料来源丰富、含量高（要考虑收率）、杂质少、成本低；范围包括动物植物微生物。
3）选择提取方法：选定后，要有预处理，再提取。参考第二章。
4）分离纯化方法：见后
5）均一性的鉴定：纯度鉴定主要有层析法、电泳法、超离心法，酶的鉴定还有恒比活的方法。测试方法都是相对的，所以要标明测试方法。
6、生化分离技术方案设计和选择：
0）不容物的去除阶段：过滤或离心。
1）粗化阶段：主要是出去大量的杂质，选择的方法能够满足大规模处理的需要，侧重点在速度和处理量上，一般使用均浆、沉淀技术、膜过滤技术。
2）纯化阶段：主要是进一步出去大量杂质，重点放在分辨率和处理量上，离子交换、凝胶层析在此阶段使用。
3）精制阶段：主要是除去微量杂质，重点是分辨率；采用离子交换和亲和层析技术。
原则：要保证生物活性和化学完整性。
7、发展趋势：
灌柱层析是一种快速纯化技术，POROS填料就是他的体现；膨胀床色谱技术；
高效离子交换剂：中压层析或高压层析使用粒度较小而又一定硬度和分辨率的交换剂。
发展倾向：多种纯化技术的结合（融合技术）；分离技术与发酵工艺的结合（耦合）；新型高效分离材料的开发（分子印迹技术、智能高分子材料）；新型分离技术。
8、生物分离过程的关键技术：过滤、离心、膜分离、萃取、吸附交换、工业色谱、电泳技术、结晶、干燥、蒸馏与精馏技术。
二、预处理
1、样品分离的预提取过程
1）植物组织提取物的制备：
植物中酶的提取必须从含有酚、多酚的植物组织中提取，而大量酚的存在给提取带来了困难。酶、酚在植物组织中处于间隔状态，当植物组织破坏后，酚、酶混合接触，发生反应，反应产物苯醌和单宁酸还会继续与酶蛋白发生反应，这样的过程往往使要提取的目的酶失去活性.
注意：提取液的量一定保证“充分侵入”；搅拌适当；PH值5.5-7
二、动物细胞提取：
1、器官的选择：
在不同的器官中，蛋白的数量是不同的，如心脏容易得到澄清液，而肝脏的核酸和脂肪（包括可溶性蛋白）要多些；刚宰杀的器官要去除脂肪和筋皮，马上放入-10℃的冷库中。
脂肪本身容易氧化酸败，导致变质，还会影响后期纯化。一般的脱脂方法有：人工去除脂肪组织；浸泡在脂溶性的有机溶剂中脱脂；快速高温、快速冷却除油块；油脂分离器。
如果蛋白质存在于亚细胞中，如线粒体，亚细胞分离会很容易，但也会限制蛋白质的量。因此大量提取的可行办法是传统方法均浆化器官。
2、注意事项
1）均浆：在机械力和渗透压的结合作用下，缓冲液中的动物细胞膜很容易被破碎。经过离心、均浆后澄清。肝、肾、心脏、脑都是容易均浆化；纤维化的需要冷冻。
2）缓冲液的选择：中性PH值，适当离子强度（如0.1mol/L的磷酸缓冲液，PH7.0）。在静电力下，有些蛋白会黏附在碎片上，加入0.1mol/L的NaCl会提高蛋白收率。
3）蛋白抑制剂：一般来说，蛋白浓度高，其他蛋白会保护目标蛋白；但是有些目标蛋白更易受蛋白酶的影响，纯度越高，蛋白降解会成为大问题，这完全取决于蛋白和器官的来源。使用蛋白酶抑制剂，在大规模提取时，成本会很高，所以尽量避免。理想情况是，分时段测定目标蛋白是否有可测损失，如果有，采取措施。
4）保护剂的添加：有些蛋白易氧化，需要在提取液中加入0.1mmol/L的二硫赤藓糖醇或0.1mol/L的β巯基乙醇；重金属要加入EDTA。
5）离心条件的选择：相对离心力=1.118×10-5×n2×r;缓冲液：器官=2:1.
6）提取液的澄清：心脏类的有足够的澄清度，但是肾脏、肝、脑等在柱层析之前一定去掉颗粒物。方法首先要考虑高速离心（如果均浆液中有核酸和核蛋白引起黏度增大，而降低沉降速率，需加入聚胺类物质，如精蛋白硫酸盐g/L）；另一种方法是热沉淀。
纯化方案第一个步骤是盐析或有机溶剂沉淀，澄清问题此时可以不用考虑；但是，如果目标蛋白和其他粒子一起在盐析中沉淀，那就必须要先解决澄清问题。
3、处理过程
出冷库解冻切片、绞碎（3mm）送至提取罐
详解：原料标准见CG001，贮存在-10度以下；解冻2h；切片3cm厚，3mm肉末；
提取液：市政水3700L，缓加入12L硫酸，搅拌5min，加入48kgNaCl，搅拌30min；用开水调节到4000L、25-28℃，并检测PH1.6-2.0之间。顶洗液：配置6000L水，3L硫酸。
处理：肉末加入到提取液搅拌3h，再搅拌提取14-18h，T：16-19℃；PH：2.3-2.6；
出料：蛋白含量在6mg/ml以上出料，过浆；
压滤：粗液每4000L加入200Kg珍珠岩，压滤收集清液，并顶洗。
第二章：细胞破碎
细胞破碎的难易程度不同，破碎方法也不同。
一、化学破碎方法：要离心
化学破碎方法主要有渗透冲击法、增溶法和脂溶法。酶消化法反应条件温和，但是价格昂贵，无法工业化生产；碱处理法反应剧烈，且选择性差，容易造成蛋白、酶失活，少用。
渗透冲击法：是最简单的，将一定体积的细胞液加入到2倍体积的水中，导致细胞吸水膨胀破裂。对大规模的动物细胞，特别是血红细胞，快速改变浓度十分有效。
化学渗透法：将细胞放入其2倍体积的表面活性剂中，增加细胞壁的溶解度，使之破碎。表面活性剂：阴离子（SDS、脂肪酸盐）、阳离子（烷基铵盐“洗发剂”）、非离子（烷基苯酮醇）；增加万倍以上的溶解度，适用于大肠杆菌，但是后期要处理表面活性剂。
脂溶法：将细胞悬浮液加入到10%的甲苯（毒）中。其他如癸烷、辛醇。适用酵母类。
二、机械破碎法：其中均浆法和珠磨破碎法适用于大规模生产，超声波适用于实验室。
珠磨法是进入珠磨机的悬浮液和极细的玻璃小珠或石英砂等快速搅拌研磨时细胞破碎，在珠液分离器的作用下，珠子滞留在机器内。一般卧式优于立式，采用夹套冷却。如果提高破碎效率，需要增加珠量，延长时间、提高转速，这样总消耗增加，制冷也增加，过高的破碎效率碎片越小给后面的固液分离带来了麻烦（进料速度，细胞浓度）。用于动物细胞。
高速均浆法（片、孔）：——高压均质仪；机器由高压泵和均浆阀组成，原理是通过高压剪切、碰撞、渗透压破碎细胞。影响因素有压力、温度、通过均浆器的次数。压力一般在30-60MPa，压力大，破碎效果好，但是对机器的损耗也大；缺点是要循环多次才能达到效果。使用于微生物、大规模细胞破碎。
最佳的细胞破碎条件：应该从高的产物释放率、低能耗和便于后步提取三方面权衡。第三章沉淀技术
一、概述
沉析一般发生在过滤或离心之后。沉淀是溶质由液相沉积为固相的析出过程；本质是通过改变条件使胶粒发生聚结，降低液相中的溶解度。如是除去液相浑浊成分，沉淀起到了澄清和分离的作用；如果需要沉积在固体的成分，沉淀起到了浓缩和分离的成分。一个分离设计需要考虑两种情况。沉淀和结晶是同一个过程，都是新相析出的过程。区别两者看分子析出过程是否有序。
沉淀法特点是简单、成本低、原材料易得，在产物浓度越高溶液中沉淀越有利，收率越高；缺点是聚集多种杂质（共沉），产品纯度比结晶法低。
沉淀技术对于分离纯化是有选择性的，还要注意沉淀剂对生物活性物质是否有破坏作用。沉淀技术是利用溶解度的差异，根据结构改变溶液中的某些性质（PH、极性、离子强度等）是溶解度发生变化。
二、沉淀方法
1. 盐析法：
1）原理：生物大分子以亲水胶体的形式存在于液体中，无外界影响是很稳定的，一是一定PH值下显示一定的电性，静电斥力作用互相排斥；二是蛋白质周围水分子有序排列形成水合膜，保护蛋白质避免碰撞而聚沉。
一般来讲，低浓度中性盐离子对电解质物质分子表面极性基团和水活度的影响，会增加这些物质与溶剂的相互作用，使溶解度增大，这一现象成为“盐溶”现象。但是，中性盐的浓度继续增加时，它们的溶解度反而降低，以致使电解质类物质在溶液中沉淀出来，这就是盐析作用。
机理是低盐时，蛋白质表面疏水区被水分子包围，都未暴露出来，当加入大量的盐时，大量水和盐结合（盐亲水性比蛋白质大），水分子定向排列，活度减少，使蛋白质疏水区暴露，表面电荷也被中和（静电排斥作用减弱），蛋白质互相结合沉淀。
Pr+nH2O→Pr·nH2O Pr·nH2O+ Pr·nH2O→Pr-Pr+（m+n）H2O ΔG0=ΔH0-TΔS0
盐浓度升高时，水被束缚，G值降低，上式右移，Pr-Pr聚到足够大发生沉淀。适当升高温度，可以提高盐析速度，但是要注意生物活性。
①单一蛋白质：经验式：lgS=β-k S I S蛋白质溶解度，β是I=0时的lgS，I是盐浓度，K s是盐析常数。K s与PH、温度无关，依赖于蛋白质性质和离子强度；β值与蛋白质性质、盐种类、温度（↗↘）、PH都相关，但是影响甚微（分级盐析相关），一般来说，蛋白带电荷越多，溶解度越大；原始浓度：原始浓度有双重影响，一方面影响沉淀极限，一方面增加
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
了共沉作用
．．．．．，原始浓度低，需用的离子强度就大，反之相反。蛋白质浓度一般控制在
2.5-3%（25-30mg/ml）
②混合蛋白质的盐析：
●合适的盐析范围：不同蛋白质盐析峰会重叠，权衡回收率和纯度；盐析沉淀最适合
沉淀分级范围是8%（收率90%），盐析范围宽，回收率高，但是纯度降低；
●改变浓度：如果沉淀峰重叠，可以适当稀释；
●二次盐析：分步盐析
总之，蛋白质盐析操作有两种方法：一是固定蛋白质溶液的PH值和温度，变动离子强度达到沉淀的目的，称为k S盐析；二是在一定的离子强度下，变动PH值和温度达到沉淀的目的，称为β盐析。K s盐析共沉作用大，影响分辨率，因此多用于前期，后期多用β盐析。
中性盐进行分离时，有三种情况:一是目的物在相对狭窄的浓度范围内沉淀，有很大的比活性；二是较宽的含有杂质的沉淀；三是某组分高度可溶，除去杂质，目的物留在上清液。
盐析一般在纯化方案的初始阶段，后期目的物浓度降低不合适盐析操作了。
2）盐析操作要点：
①盐的种类选择：盐析作用强、溶解度大、生物惰性、来源经济、缓冲强。磷酸盐贵
中性盐有(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4、NaCl、柠檬酸钠等。一般，半径大单价盐效果差，半径小多价盐效果好；阴离子比阳离子效果好。离子主要排序如下：
柠檬酸根>酒石酸根>磷酸根>F->SO42->Cl—>次氯酸根>Br—>NO3>I—；
Al3+>H+>Ba2+>Ca2+>Mg2+>Rb+>NH4+>钾>钠离子>锂离子；
(NH4)2SO4、Na2SO4应用最广。特点：一是(NH4)2SO4（三级纯）溶解度大、密度小、受温度影响小、价廉；二是只能在PH<8的范围内使用，大于8会有氨气放出（如果这种情况，应该用柠檬酸盐）。Na2SO4也常被应用，优点是不含氮，但是在30℃以下溶解度太低。
②盐析范围的确定：从下表中可以看出要选择是纯化倍数还是回收率，饱和度在45-70%回收率可达到94%。综合考虑。
③盐的加入方式：使用时必须看清表上的规定温度。
●固体盐加入要分次缓慢加入（均匀），防止产生泡沫和过热，达到溶解平衡再继续加入。
●如果加入液体，常用饱和度来表征硫酸铵：25℃饱和度为4.1mol/L（100%）。有表
X=G(P2-P1)/(1-AP2) X是1L溶液需要硫酸铵的质量；P1\P2是初始和最终溶液的饱和度，%；G是经验常数，25℃为513，0℃为515；A是常数，0℃为0.27，20℃为0.29。
④蛋白质浓度：不要太稀，也不要太高，防止共沉，不同浓度的蛋白质所要求的临界盐浓度不同，蛋白含量最好控制在2-3%；PH值最好在等电点；温度，高盐下温度越高，溶解度越低。注意蛋白质沉淀后在4℃放3个小时以上或过夜，形成较大的沉淀。
其他方法还有反渗透法和反抽提法
1.2 处理过程
浓缩：将上一步的清液中转到浓缩罐，进入超滤器浓缩，P：0.1MPa；弃液蛋白含量5mg/ml。当蛋白含量达到50-60mg/ml浓缩完成，转到盐析罐；
盐析：
2、有机溶剂沉淀法：
蛋白质、核酸等物质加入亲水性
．．．有机溶剂，它们的溶解度显著降低，并沉淀出来的方法。
1）基本原理：沉淀机理主要有两个方面：一是静电作用：有机溶剂加入会降低介电常数，从而增加了蛋白质等粒子间的引力，发生吸引沉淀（F=q1q2/εd2）；二是脱水作用：亲水的有机溶剂加入后，争夺蛋白质等表面水分子，使其碰撞沉淀。
相比：脱水作用大于静电作用。
2）沉淀条件讨论：
①温度：高温会引起变性，防止有机溶剂溶于水放热，要预先降低有机溶剂的温度-20，
必要降低有机溶剂的浓度；
②PH值：等电点溶解度最低，且大多数蛋白质带有相同电荷；
③蛋白质浓度：最好在0.5-3%之间；
④离子强度：越高，需要的有机溶剂浓度也越大，离子强度在0.01-0.05molL；；
⑤有机溶剂的选择：需要考虑介电常数小、沉淀强；对生物分子变性作用小；毒性小；
能与水无限互溶。乙醇应用最多。
⑥多价阳离子：可以降低蛋白质在有机溶剂中溶解度，但要避免与磷酸根溶液。
⑦溶液用量：V=V0(S2-S1)/(S0-S2)
3、等电点沉淀法
1）原理：蛋白质等溶解度与所带电荷多少有关，一般来说，不管酸性还是碱性，只要偏离等电点，所带电荷要么正要么负，分子之间有排斥作用，只有在等电点引力最大，最有可能沉淀，因此在该点沉淀出来的就是等电点沉淀。
蛋白质分子分布了很多极性基团，结合水分子形成水化层，在等电点并不一定沉淀，只
有破坏水化层才可能发生沉淀。此方法一般配合其他方法一起使用，如盐析法。
2）沉淀条件讨论：
与其他方法共用；离子强度要综合考虑；溶质表面极性的影响。
4、非离子多聚物沉淀法PEG、PVP、葡聚糖都可以用于沉淀蛋白
分离大分子和微粒一般有两种方法：一是选用两种水溶性非离子多聚物组成液-液两相系统，使生物大分子因不同的分配系数而不等量分配，再加上PH、温度、离子强度以增强效果（实际是萃取）；二是用一种水溶性非离子多聚物，生物大分子在单一相中被排斥而沉淀析出（先出去大颗粒）。
1）原理：主要基于体积不相容性。PEG分子在溶剂中排斥蛋白质，可能发生共沉，可能产生复合物沉淀。医药级PEG尽量选择低分子量的，并且多用于病毒和细菌。
2）影响因素：盐浓度越高，需PEG浓度越低；PH值一定是在等电点附近需PEG越低。PEG的相对分子质量相对较高要好些（6000）。
5、选择性变性沉淀：
1）原理：有些被分离物质能忍受剧烈条件，杂质却因为不稳定而变性沉淀。
2）变性沉淀的种类：a热变性沉淀：需要注意温度升高使酶活升高，被分离物有被水解的风险，因此最好在硫酸铵中进行；二是除了合适PH值、温度外，也要考虑保温时间b、PH变性沉淀：可靠、快速，要全面了解分离物和被分离物的性质。c、有机溶剂变性沉淀。
6、复合盐沉淀法：有：与生物分子酸性功能团作用的金属复合盐法（H2S除金属）；与生物分子碱性功能团作用的有机酸复合盐法（无机酸与乙醚萃取）、无极复合盐法。
能与酶形成复合物沉淀的是酶（蛋白质）沉淀剂，常用单宁、聚丙烯酸高分子聚合物7、亲和沉淀：是利用专一性。一次作用亲和沉淀仅用于多价、特别是4价以上的蛋白质，多配基和多价蛋白质发生交联而沉淀（沉淀条件不好掌握）；二次作用亲和沉淀：是亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使溶解度下降，如可逆沉淀性聚合物（SIS）。
8、大规模沉析过程：
1）初步混合：混合时间t=l/4D2；l是末级端流混合长度，D是扩散系数。末极端流是各向同性的，l=（ρμ3/P/V）1/4，ρ是溶液密度，u为黏度，P/V是单位体积输出功率。
2）起晶：生物体系瞬间完成
3）扩散控制晶体生长：涉及分子量的计算；
4）对流沉析：5)絮凝阶段。
附三章：过滤
第五章、凝胶层析凝胶是具有多孔网状结构的分子筛，对大小、形状不同的分
子进行层析。
凝胶过滤层析（GF也有称之为排阻层析），是按分子大小进行分离的手段。1959年交联葡聚糖凝胶诞生，它是有线性葡聚糖分子经过氯醇交联而成，增加了机械稳定性，根据交联程度限定了分级范围。
凝胶层析的优势：1）凝胶介质不带电荷，良好的稳定性，分离条件温和，回收率高，重现性好；2）一般情况下，小分子、离子、去污剂、表面活性剂对分离不产生影响，能在不同的PH值、温度下进行；3）应用范围广；4）设备简单、介质可反复使用。
一、原理
三维网状结构的介质存在大量间隙，只有小分子由于扩散作用可以通过颗粒介质的内部而被滞留，大分子被排阻在颗粒外部，在颗粒间迅速通过。
1）影响因素：凝胶技术是按分子大小进行分离的，与M直接相关，每一种凝胶介质都有特定的分子量分级范围（凝胶介质的主要参数）。根据分级范围，把溶质分子分为三种：一是大于分级上线的全排阻分子，从颗粒间通过，流程最短，首先从层析柱中出来；一是小于分级下线的全渗透分子，流程最长，最后出来；在分级范围内的是部分渗透分子，它们不同程度的进入凝胶颗粒内部，是凝胶介质有效分离的对象。如果两种物质的分子量都大于上线或都小于下线，则无法分离。
影响洗脱快慢的不仅仅是分子量，还有分子的形状
．．．．．．．．．．．，对称性高的则容易进入凝胶内部，洗脱时间长。
2）分级分离的两种类型：
一是分子量极为悬殊的两类物质分开，称为类分离或组分离；
另一类是分子量相差不大的大分子物质加以分离，叫做分级分离。
3）有关理论的问题：
●凝胶柱的体积参数：总柱床体积V=凝胶体积Vg+外水体积V0+内水体积Vi；柱体积是
从柱底板到凝胶沉积表面的体积。
●洗脱体积及分配系数：在凝胶柱洗脱时因保留时间不同而分离，但表示在层析柱停留程
度时，通常采用洗脱体积Ve，定义为从样品加入开始到洗脱组分达到最大浓度时流出洗脱液的体积（洗脱峰）。柱下端一般与检测器（UV）相连。全排阻分子的洗脱体积Ve=V0，全渗透分子的洗脱体积Ve=V0+Vi。凝胶层析存在一个分配系数Kd，Ve=V0+Kd·Vi。Kd>1的情况，如疏水作用、亲和作用和静电作用使洗脱变后。Kd 的测定V0可以用蓝葡聚糖2000（二百万），根据上式变化求出，内水体积测定干胶质量乘以单位凝胶吸水量，但是Vi的测定还有不确定性。
●分辨率：Rs=2(V e2-V e1)/（W b1+W b2）V2/V1是峰1、2的洗脱体积；W 是两峰的峰宽。
决定着两种的因素包括组分的分子大小，凝胶柱的选择性和柱效。
选择性：用相对保留值α来表示：α=（V2-V0）/（V1-V0）；
选择性是系统分离不同组分的能力，好坏取决于凝胶的特性。
柱效：理论塔数N是每米层析床所包含的理论塔板数：N=5.54（V e/W h）2；V是洗脱体积，W是洗脱峰半峰高的宽度。还可以用理论塔高度H表示：H=L/N。较长的柱，细的介质。
二、凝胶过滤介质
1）必须满足的条件：较强的机械的稳定性、高化学稳定性（方便清洗和消毒）、球形均匀呈现亲水性、不带电荷。
2）凝胶过滤介质参数和性质：
●粒度：指溶胀后凝胶水化颗粒的大小，用水化颗粒的直径来表示（um），也有用干颗粒直径表示的。用于层析的一般在5-400um的范围内，关系到分离效果。粒度越小，层析柱理论塔板数就越大，分离效果就越好，但是分离样品就越少，层析过程压力增大，限制流速的提高，对设备要求也高，因此细颗粒适用于分析型分离；颗粒大些分离样品量大些，使用于中小规模的制备型分离。除此，颗粒均一性也影响分离效果。
●交联度和网孔结构：网孔结构式通过交联剂将相邻的线性分子链接而成（琼脂糖sepharase除外）。交联度决定了凝胶的分级范围，因此也有不同的分级范围的凝胶如sephadex G10 G15……
●多孔性取决于Vi/（Vi+Vg），凝胶颗粒的渗透性定义为凝胶柱内体积与外内水体积之比。得水值又叫吸水值、膨胀度，定义为每克干胶吸附水的体积，单位为ml/g。
●机械强度：层析操作中，层析柱承受的压力降和所采用的流速规定了介质必须具备一定的强度。
●物理和化学稳定性：物理稳定性主要是承受高温高压的情况。比如灭菌，物理性能好的采用高压，否则采用化学灭菌法。此外，介质填充层析柱后，对操作稳定也有一定的要求，超出温度范围对柱效产生影响，这种情况下要重新填充
●化学稳定性：PH值稳定，用酸用碱是清洗凝胶的常用手段，要求极端PH下具有短程稳定性而不被降解。
3）凝胶过滤介质的种类：
按基质组成可以分为葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、二氧化硅以及混合凝胶，按凝胶层析达到的柱效和分辨率可以分为标准和高效介质凝胶，前者特点是颗粒较大，典型的为100-250um，后者为二氧化硅和高交联琼脂糖的介质，特点颗粒小，典型为5-50um，机械强度相对较高，柱效高，价格贵。
①葡聚糖凝胶：sephadex称为葡聚糖凝胶，由安玛西亚公司生产。葡聚糖又称右旋糖酐，合成sephadex有一系列不同型号，表示为sephadex G加个数字，数字越小，交联越大，分级范围越小，G200交联度最小。G后面数值相同情况下，凝胶颗粒又可以分为粗、中、细、超细不同规格，颗粒越细，操作压力也越大。数字越大，网孔越大，适用于高分子。
葡聚糖中含有大量的羟基，有较强的吸水性，G后面的数值粗略的表示了10g干胶的得水值（ml）。溶胀时，沸水脱气，避免剧烈搅拌，防止凝胶颗粒破裂，交联度越低，溶胀时间越长。G系列凝胶机械强度不大，不能承受高压和高流速，较高的操作压导致柱床压缩，甚至凝胶颗粒劈裂，必须严格控制流速。常用碱性液清洗，使用时避免氧化剂将羟基氧化成羧基
②琼脂糖凝胶：agarose，中性分子，琼脂糖在无交联剂的情况下也会形成凝胶，单个的链状分子之间形成双螺旋结构，进一步形成束装，维持力是氢键。
●sepharose：不交联
柱状的琼脂糖凝胶商品名sepharose，由安玛西亚公司生产，根据琼脂糖含量不同，有三种型号（2B/4B/6B “阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量”）。化学稳定性尚可，PH4-9下无氧化剂下稳定。Sepharose温度范围较窄，0-40℃，低于0度，遭受不可逆的破坏，高于40度就会溶解，一般采用化学灭菌法。Sepharose机械强度低，相比，6B大于2B。sepharose 分级范围很宽，适用于分离分子量差异很大，对分辨率要求不高的产品。
Sepharose。含有少量的硫酸基和羧基，对正电荷产生吸附，如果洗脱剂离子强度大于
0.15可以避免这种吸附。做成凝胶后不再脱水干燥，否则不能回复原有形状。
●sepharose CL：
CL表示交联。sepharose靠氢键来维持，强度和稳定性不是很理想,用2,3二溴丙醇交联，PH稳定范围、机械强度、稳定性都有很大的提高，能够在121℃反复高压灭菌，但是要避免氧化剂。
●superose：目前最好的
安玛西亚公司生产高分辨率、高机械强度、分级范围宽的新型凝胶介质，在柱状琼脂糖颗粒上两次交联得到。分为sepharose 6 和sepharose 12 两类，每类又分为普通级和制备级，制备级颗粒要粗些。Sepharose机械强度好，适合于高速分离过程，同样洗脱剂离子强度要大于0.15。Sepharose 4 and 6 Fast Flow乃高度偶联的琼脂醣介质，流速特快。
●Bio-Gel A A是数字如0.5M，数字乘以106表示排阻限度。
Bio-Gel A系列由伯乐公司开发，与separose结构相同，但是温度稳定性差（2-30℃）。产品还有法国
．．．．．．．系列、丹麦
．．．．．Gelarose
．．．．．．
．．．．．．．．系列、中国产
．．．Sagavac
．．IBF
．．．．．．．．．．．、英国
．．．公司、美国
．．．．．superAgogel
QT．．系列
．．。
③丙烯酰胺凝胶：
目前最常见的是伯乐公司生产的Bio-Gel P系列凝胶，分为7个型号，P后面数值越大（数字乘以1000相当于排阻限度），交联度越小，粒径不同的规格。与G系列接近，但是稳定性不如sepharose G系列，强酸强碱容易水解。
④复合结构凝胶：
●sephacryl HR：烯丙基葡聚糖+Bis。颗粒尺寸分布窄、低流速可以获得很高的分辨率，
机械、理化性能都优于传统凝胶介质。优于机械强度高，可以承受高的背景压力，适用于高流速快速分离；PH稳定性好，可以用0.5mol/L的NaOH清洗。
●superdex：安玛西亚公司生产，是目前分辨率和选择性最高的凝胶介质之一
（100-7000）。Superdex是葡聚糖和高度交联的琼脂糖颗粒共价结合的复合型凝胶。琼脂糖决定了高度理化稳定性，Ph 0-14都可以工作，葡聚糖链决定了凝胶的层析性能。
可以承受很高的流速，可以高压灭菌。填充好的superdex层析柱使用温度为4-40度，超出温度会破坏柱效，必须重新装柱。清洗方案是0.5mol/L的盐酸和氢氧化钠。
●ACA系列凝胶是琼脂糖和聚丙烯酰胺混合型凝胶介质。
⑤其他类型的凝胶。
四、试验方案设计需要注意一下几点：
1、凝胶过滤介质的选择：取决于分离的范围、目标、样品的性质、试验操作条件
1）分离目标和凝胶过滤介质的特性：生化分离过程有分析型和制备型分离。分析型分离的样少，用于分子纯度的测定，分子量的测定和分布；制备型样品较多。
同一交联度型号又分为多种规格，如粗、中、细、超细。凝胶颗粒越细，柱效越高，洗脱峰窄，分辨率也越高，但背景压力高，价格也贵。一般情况，粗规格适合于数量较多的样品分离；中规格适合于少量样品的制备，常规分析测定；超细规格凝胶适合微量样品分析。
在大规模工业生产中，对分辨率要求往往退居其次，而对生产能力、分离时间和分离成
．．．．．．．．．．．．．
本的要求较高
．．．．．．，此时应当选用颗粒较粗、机械强度较大，易于清洗和重复使用的凝胶介质。
2）选择性曲线和分离范围
待分离物质的分子大小是决定选用何种介质重要的因素，要在凝胶的分级范围内。另外，凝胶介质的选择性曲线对于指导凝胶的选择很有帮助。每种介质的选择都有针对球形蛋白和针对线性葡萄糖两种，应该根据目标分子的形状更接近哪一种来确定选择性曲线。
3）样品和洗脱剂特性：除上述之外，目标分子的种类和凝胶的选择也有重要关联。
洗脱剂可以选择温和的，不会对介质产生不良影响的。但是有时可能含有不良的组分导致层析样品失活甚至在柱中沉淀的现象。
2、洗脱剂的选择
理论上讲，如果分离物质不带电，可以直接用蒸馏水洗脱，然而一般都采用缓冲液。缓冲液首先要考虑PH值，一般在中性附近，采用的缓冲物质解离常数PKa接近这个PH值，使用最多的是磷酸缓冲液（PKa7.2）和Tris（8.1）缓冲液。
凝胶介质多少带有些负电荷，会影响过滤结果，离子强度的增加会减少溶质间的离子作用，一般用满足0.15mol/L的离子强度。NaCl是最常使用的盐类，缺点是有点腐蚀能力。凝胶层析如果发生在纯化方案末期，在冻干之前，需要盐析掉缓冲液，而且宜采用挥发性高的缓冲液。抑菌剂叠氮钠。
3、层析柱的选择：
特点：柱壁材料结实，能承受压力；层析柱出口和入口的死体积尽可能的少，低于柱体积的0.1%；合理的凝胶床支持物，不易被堵塞；拆卸容易，方便清洗。当然有机溶剂、极端PH值和背景压力也要考虑。
尺寸常用内径和高度（mm）来表示，可以计算出柱体积和高径比。分辨率Rs与柱长的
平方根呈比例，分析型分离要求分辨率高，采用柱长的，不过很少超过1m。
4、预装柱：为了获得高分辨率，一些公司将介质装成预装柱。
五、层析技术
设计完成后，选择好的凝胶介质、层析柱、洗脱剂、样品，进行装柱、平衡、加样、洗脱、样品检测、层析柱清洗（氯化钠）、再生，都是层析技术。
1、凝胶的准备
如果不是预装柱，则自行装柱，但依是否溶胀还有不同。市售溶胀好的，一般不需要处理，清去上清液，按湿胶：洗脱剂=3:1的比例添加洗脱剂，搅匀装柱；如果是干胶，用水溶胀，干胶用量=体积/膨胀率。
2、装柱
装柱对任何层析都很重要，填充不好会导致流速不均匀，区带扩散，对层析流速产生影响。市售层析柱有两种：一是传统的，接头位置固定的，另一类是接头可移动的，凝胶床上不要留有水柱。装柱不能有界面，可用蓝葡聚糖2000测定。
3、样品和洗脱剂的准备
高分辨率介质或预装柱时，配置洗脱剂须是分析纯的，过滤的。粒度90um以上的介质滤膜口径1um；小于90um的使用0.45um的孔径，甚至是0.22的。
样品的黏度也是影响上样量和分离效果的因素，为了避免粘性手指效应，样品黏度和洗脱剂黏度之比应小于1.5.
4、加样：
1）加样量：因为分辨率Rs与样品体积/柱体积有关，该比值增大，分辨率下降；分析型分离和难度较大的分离，对分辨率要求较高，因此加样体积在0.5-5%；在脱盐、缓冲液组别分离时，加样可以达到柱体积的30%，如果需要很高的回收率，比例须减少到15-20%。
加样是将一定溶液均匀加到床面，床面有一段水柱，防止破坏床面平整性，使洗脱峰变宽。
5、洗脱技术
恒定流速一般靠静水压（软胶）和泵来控制（当然也受柱的材料、尺寸、连接方式、泵的种类和介质的机械强度影响）。生产效率尽可能的要求流速大，但分辨率会下降。
6、检测
7、介质过滤与再生：用氢氧化钠（清洗堵塞、杂质）和氯化钠清洗一个柱体积。葡聚糖和琼脂糖介质还要加入一些抑菌剂。
六、应用：脱盐、缓冲液置换、相对分子质量测定、混合物分级分离。
第八章蒸馏和精馏
按操作流程分有间歇操作和连续操作（大规模）；
按蒸馏方式有简单蒸馏、平衡蒸馏（闪蒸）、精馏和特殊精馏（较难分离）；膜蒸馏。
按操作压力分为常压、加压和减压蒸馏，热敏性和沸点高可以采用减压蒸馏。
一、蒸馏原理
1、双组份平衡原理
1）相律：F=C-Φ+2 F是自由度，C是相数，Φ是独立组分数，2是只有压力和温度两个条件。
溶液蒸汽压：一定温度下，气液达到平衡，液面上蒸汽压强就是该组分蒸汽压，如果有两个组分，则两个组分的分压都小于纯组分的蒸汽压P A
道尔顿分压定律：y A=P A/P,P=P A+P B, y是气相组分的摩尔分数。
2）拉乌尔定律：P A=P A0x A，P B=P B0(1-x A)，x表示液相中易挥发组分的摩尔分数，y表示气相中易挥发组分的摩尔分数；x=（P-P B0）/(P A0-P B0),y=P A0/P 。以上均以理想溶液。
3）挥发度：是指在一定温度下的饱和蒸汽压，两组分的挥发度v A=P A0。
相对挥发度：两组分的挥发度之比，α=v A/v B=（P A/x A）/（P B/X B)= y A x B/y B x A。
一般可将α视为常数，气液平衡方程：y=αx/1+（α-1）x。α>1或者值越大，分离愈容易，α=1时，普通蒸馏就无法分离了。泡点线和露点线。
4）双组份非理想溶液：a、正偏差溶液：混合液间的吸引力小于纯溶液时，混合后溶液更容易气化，从而导致蒸汽压变大，这种混合液称为与理想溶液发生正偏差的溶液。
b、负偏差溶液：混合液分子间吸引力大于单纯组分的吸引力。如硝酸-水、氯仿-丙醇。
第十二章：离心技术
密度差较小，颗粒较细，用离心沉降技术大大提高沉降速率。是一种利用离心力、颗粒物质的沉降系数、质量、浮力因子的差别进行分离、浓缩和提纯的方法。局限性是不能分离颗粒大小一样、密度一样的颗粒。
一、离心设备：
1、离心机：有工业级和实验室级；转速有低速（10000r/min以下）、中速（25000）、超速；
主机主要有驱动系统、真空、恒温、控制、润滑系统，部分由光学测试系统。
驱动系统多是变频电动机，冷却电动机的方式为水冷或风冷；为了防止驱动轴爆炸，要求驱动轴一定的区带弯曲，离心管中同密度样液质量不差过0.1g。真空系统：低速离心机可以用冷冻机制冷；超速离心机使用油旋转真空泵加上油扩散真空泵，因此对于密封要求也很高。控制系统主要控制速度、温度、真空度等。
在跨音速去以下，空气扰动小，高速离心机（20000左右）宜收集碎片、细胞器等。2、转子：转子一般由钛合金和铝合金制备，分为角式转子、水平转子、垂直转子和区带转子。离心室为了防止转子爆炸有钢柱和安全门保护，对材料、平衡等有很高的要求。
选择转子的要求：额定转速、容量、形状、使用寿命。
3、离心管：管体的管口有光口和螺口两种，一般都有管盖。通常有玻璃、塑料和金属（不易观察）制成。离心管选用：容量、离心强度、转速、耐腐蚀性。
二、基本原理：
1、相对离心力：离心加速度a=v2/r ；离心力F=ma ；v=rω；——①
由转速表示：F=mω2r =m（2πn/60）2r 与质量、半径、转速相关——②
相对离心力是物质受到离心力与重力之比：RCF=ω2r/g=1.118×10-3n2r——③
离心力习惯上用相对离心力和g的乘积来表示，例如5000g。
2、沉降速度：参考斯托克斯公式；沉降速率v=d2（（δ-ρ）/18u）ω2r；——①
在重力场中将ω2r换成g，称为自由沉降速率。
3、沉降系数：s= d2（（δ-ρ）/18u）v=sω2r ——②
可以看出，物质颗粒的大小和性质、液体粘度、颗粒密度都与离心沉降有关。s值一般很小，一个单位为10-13。
4、离心时间和K因子
5分子质量的计算
四：超离心技术：
有差速离心法、密度梯度区带离心法
五、符合GMP的离心机
GMP规范：防止微生物；接触表面不与被分离材料反应；内表面抛光，转角圆弧；离心机有就地清洗的条件；离心机外壳开启有多种方式，以充分检查；防静电；蒸汽压力进行灭菌；具备辅助检测功能；物料工艺区与传动部分分离开（穿墙设计）。
GMP要求设备设计主要考虑：基础设计、滤饼自动清除、离心篮设计、污染免除设计。
六、离心设备：工业分离机分为过滤离心机、沉降离心机和离心机三类。
三足式离心机、管式分离机、碟片式分离机、连续流分离
生物分离工程答案1
《生物分离工程》练习题一（第1~3章） 一、选择题 1、下列物质不属于凝聚剂的有（ C ）。 A、明矾 B、石灰 C、聚丙烯类 D、硫酸亚铁 2、发酵液的预处理方法不包括（C ） A. 加热B絮凝 C.离心 D. 调pH 3、其他条件均相同时，优先选用那种固液分离手段（B ） A. 离心分离B过滤 C. 沉降 D.超滤 4、那种细胞破碎方法适用工业生产（ A ） A. 高压匀浆B超声波破碎 C. 渗透压冲击法 D. 酶解法 5、为加快过滤效果通常使用（ C ） A.电解质B高分子聚合物 C.惰性助滤剂 D.活性助滤剂 6、不能用于固液分离的手段为（ C ） A.离心B过滤 C.超滤 D.双水相萃取 7、下列哪项不属于发酵液的预处理：（ D ） A.加热 B.调pH C.絮凝和凝聚 D.层析 8、能够除去发酵液中钙、镁、铁离子的方法是（ C ） A．过滤B．萃取C．离子交换D．蒸馏 9、从四环素发酵液中去除铁离子,可用（ B ） A．草酸酸化B．加黄血盐C．加硫酸锌D．氨水碱化 10、盐析法沉淀蛋白质的原理是（ B ） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 11、使蛋白质盐析可加入试剂（ D ） A：氯化钠；B：硫酸；C：硝酸汞；D：硫酸铵 12、盐析法纯化酶类是根据（ B ）进行纯化。 A.根据酶分子电荷性质的纯化方法 B.调节酶溶解度的方法 C.根据酶分子大小、形状不同的纯化方法 D.根据酶分子专一性结合的纯化方法 13、盐析操作中，硫酸铵在什么样的情况下不能使用（ B ） A.酸性条件B碱性条件 C.中性条件 D.和溶液酸碱度无关 14、有机溶剂沉淀法中可使用的有机溶剂为（ D ） A.乙酸乙酯B正丁醇 C.苯 D.丙酮 15、有机溶剂为什么能够沉淀蛋白质（ B ） A.介电常数大B介电常数小 C.中和电荷 D.与蛋白质相互反应 16、蛋白质溶液进行有机溶剂沉淀，蛋白质的浓度在（ A ）范围内适合。 A. 0.5％～2％B1％～3％ C. 2％～4％ D. 3％～5％ 17、生物活性物质与金属离子形成难溶性的复合物沉析，然后适用（ C ）去除金属离子。 A. SDS B CTAB C. EDTA D. CPC 18、单宁沉析法制备菠萝蛋白酶实验中，加入1%的单宁于鲜菠萝汁中产生沉淀，属于( D )沉析原理。 A盐析B有机溶剂沉析C等电点沉析D有机酸沉析 19、当向蛋白质纯溶液中加入中性盐时，蛋白质溶解度（ C ）
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，
生物分离技术题库(带答案)
题库名称:生物分离技术 一、名词解释 1.质量作用定律:化学反应得速率与参加反应得物质得有效质量成正比。 2.凝聚:在电解质作用下,破坏细胞菌体与蛋白质等胶体粒子得分散状态,使胶体粒子聚集得过程。 3.分配系数:在一定温度、压力下,溶质分子分布在两个互不相溶得溶剂里,达到平衡后,它在两相得浓度为一常数叫分配系数。 4.干燥速率:干燥时单位干燥面积,单位时间内漆画得水量。 5.CMSephadex C50:羧甲基纤维素、弱酸性阳离子交换剂,吸水量为每克干胶吸水五克。 6.絮凝:指在某些高分子絮凝剂存在下,在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大得絮凝团得过程 7.过滤:就是在某一支撑物上放过滤介质,注入含固体颗粒得溶液,使液体通过,固体颗粒留下,就是固液分离得常用方法之一。 8.萃取过程:利用在两个互不相溶得液相中各种组分(包括目得产物)溶解度得不同,从而达到分离得目得 9.吸附:就是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附得能力,使其富集在吸附剂表面得过程。 10.反渗析:当外加压力大于渗透压时,水将从溶液一侧向纯水一侧移动,此种渗透称之为反渗透。 11.离心沉降:利用悬浮液或乳浊液中密度不同得组分在离心力场中迅速沉降分层,实现固液分离 12.离心过滤:使悬浮液在离心力场作用下产生得离心力压力,作用在过滤介质上,使液体通过过滤介质成为滤液,而固体颗粒被截留在过滤介质表面,从而实现固液分离,就是离心与过滤单元操作得集成,分离效率更高 13.离子交换:利用离子交换树脂作为吸附剂,将溶液中得待分离组分,依据其电荷差异,依靠库仑力吸附在树脂上,然后利用合适得洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来,达到分离得目得。 14.固相析出技术:利用沉析剂(precipitator)使所需提取得生化物质或杂质在溶液中得溶解度降低而形成无定形固体沉淀得过程。 15.助滤剂:助滤剂就是一种具有特殊性能得细粉或纤维,它能使某些难以过滤得物料变得容易过滤 16.沉降:就是指当悬浮液静置时,密度较大得固体颗粒在重力得作用下逐渐下沉,这一过程成为沉降 17.色谱技术:就是一组相关分离方法得总称,色谱柱得一般结构含有固定相(多孔介质)与流动相,根据物质在两相间得分配行为不同(由于亲与力差异),经过多次分配(吸附解吸吸附解吸…),达到分离得目得。 18.有机溶剂沉淀:在含有溶质得水溶液中加入一定量亲水得有机溶剂,降低溶质得溶解度,使其沉淀析出。 19.等电点沉淀:调节体系pH值,使两性电解质得溶解度下降,析出得操作称为等电点沉淀。 20.膜分离:利用膜得选择性(孔径大小),以膜得两侧存在得能量差作为推动力,由于溶液中各组分透过膜得迁 移率不同而实现分离得一种技术。 21.化学渗透破壁法:某些化学试剂,如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等,可以改变细胞壁或细胞膜得通透性,从而使胞内物质有选择地渗透出来。 22.超临界流体:超临界流体就是状态超过气液共存时得最高压力与最高温度下物质特有得点——临界点后得流体。 23.临界胶团浓度:将表面活性剂在非极性有机溶剂相中能形成反胶团得最小浓度称为临界胶团浓度,它与表面活性剂种类有关。 24.反渗透:在只有溶剂能通过得渗透膜得两侧,形成大于渗透压得压力差,就可以使溶剂发生倒流,使溶液达到浓缩得效果,这种操作成为反渗透。 25.乳化液膜系统:乳化液膜系统由膜相、外相与内相三相组成,膜相由烷烃物质组成,最常见得外相就是水相,内相一般就是微水滴。 26.树脂工作交换容量:单位质量干树脂或单位体积湿树脂所能吸附得一价离子得毫摩尔数称为树脂交换容量,在充填柱上操作达到漏出点时,树脂所吸附得量称为树脂工作交换容量。 27.色谱阻滞因数:溶质在色谱柱(纸、板)中得移动速率与流动相移动速率之比称为阻滞因数,以Rf表示。 28.胶团:两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成得,内含微小水滴得,空间尺度仅为纳米级得集合型胶体。 29.膜得浓差极化:就是指但溶剂透过膜,而溶质留在膜上,因而使膜面浓度增大,并高于主体中浓度。 30.超滤:凡就是能截留相对分子量在500以上得高分子膜分离过程称为超滤,它主要就是用于从溶剂或小分子溶质中将大分子筛分出来。 31、生物分离技术:就是指从动植物与微生物得有机体或器官、生物工程产物(发酵液、培养液)及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质得技术过程。 32、离心分离技术:就是基于固体颗粒与周围液体密度存在差异,在离心场中使不同密度得固体颗粒加速沉降得分离过程。 33.物理萃取:即溶质根据相似相溶得原理在两相间达到分配平衡,萃取剂与溶质之间不发生化学反应。 34.化学萃取:则利用脂溶性萃取剂与溶质之间得化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相得分配。 35.盐析:就是利用不同物质在高浓度得盐溶液中溶解度得差异,向溶液中加入一定量得中性盐,使原溶解得物质沉淀析出得分离技术。
《生物分离工程》复习内容提要
2009级《生物分离工程》复习内容提要 第一章绪论：重点节：第二节、第三节 1、生物分离工程的一般流程Page4 2、生物分离纯化工艺过程的选择依据Page5 3、生物分离过程的特点Page6 第二章发酵液的预处理：重点节：第一节 1、发酵液的一般特性Page9 2、发酵液预处理的要求Page10-11 3、发酵液预处理的方法Page11-16 4、凝集&絮凝Page11-12 5、转筒真空过滤机的结构和工作原理Page27-28 第三章细胞分离技术：重点节：第二节
1、差速离心&密度梯度离心Page31 2、比较不同细胞破碎方法（机械法、化学法、物理法和酶溶法）的原理和优缺点Page34-39 3、比较珠磨法、高压匀浆法和超声波细胞破碎法的优缺点Page34-36 4、细胞破碎的方法主要有哪些？选择破碎方法时应考虑哪些因素？（自己总结） 5、蛋白质复性及其主要复性方法（稀释与透析、色谱、反胶束）Page41-45 第四章沉淀技术：重点节：第三节 1、盐析的原理Page51 2、K s和β分级盐析法Page52 3、什么是饱和度？盐析沉淀操作曲线的制作实验步骤Page54 4、盐析操作计算Page53-54 5、主要的沉淀方法（盐析、有机溶剂、等电点、变性沉淀等）及其优缺点比较Page27-28
第五章萃取技术：重点节：第二节（二）、第三节（二、三）、第四节（一、二、四）、第六节（一、二）、第八节（一、二、三、四） 1、萃取分配系数、相比、萃取分离系数Page65 2、单级萃取、多级逆流萃取、多级错流萃取理论收率和萃余率的计算Page67-70 3、物理萃取&化学萃取Page72-73 4、水相条件如何影响有机溶剂萃取过程Page73-74 5、有机溶剂萃取剂的选择原则Page74 6、解释双水相相图Page81 7、常用的双水相系统有哪些？Page80-81 8、什么是道南电位Page82，试述道南平衡理论在双水相萃取、纳滤膜分离机制和离子交换 树脂分离机制解释中的应用。（自己总结） 9、影响双水相分配系数的主要因素有哪些？Page83-84
生物物质分离技术及原理
第九章 1.膜分离的概念：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 2.膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径大小而达到物质分离的目的，故而可以按分离粒子大小进行分类： 3.微滤（MF ）：以多孔细小薄膜为过滤介质，压力差为推动力，使不溶性物质得以分离的操作，孔径分布范围在0.025~14μm 之间； 4.超滤（UF ）：分离介质同上，但孔径更小，为0.001~0.02 μm ，分离推动力仍为压力差，适合于分离酶、蛋白质等生物大分子物质；需要增加流体的静压力，改变天然过程的方向，才可能发生含有低分子量化合物的溶剂流通过膜，此时的推动力是流体静压力与渗透压的压差； 5.反渗透（RO ）：是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作，孔径范围在0.0001~0.001 μm 之间；（由于分离的溶剂分子往往很小，不能忽略渗透压的作用，故而成为反渗透）；过程类似于超滤，只是纯溶剂通过膜，而低分子量的化合物被截留。因此，操作压力比超滤大得多。超滤和反渗透通常又被称之为“强制膜分离过程” 6.纳滤：以压力差为推动力，从溶液中分离300~1000小分子量的膜分离过程，孔径分布在平均2nm ； 7.电渗析：以电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作； 8.渗透压的大小取决于溶液的种类、浓度和温度； 9.一般说来，无机小分子的渗透压要比有机大分子溶质的渗透压高得多。 第七章 1.色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。 流动相：指色谱过程中携带组分向前移动的物质。 固定相：指色谱过程中不移动的具有吸附活性的固体或是涂渍在载体表面上的液体。 2.概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。 3.分配系数，在凝胶色谱法中，分配系数表示凝胶颗粒内部水分中溶质分子所能达到的部分，故用一定的凝胶分离一定的溶质时，分配系数也为一常数。 4.阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比，意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小 5.塔板理论可以给出在不同瞬间溶质在柱中的分布和各组分的分离程度与柱高之间的关系。所谓“理论塔板高度”是指这样一段柱高，自这段柱中流出的液体(流动相)和其中固定相的平均浓度平衡。设想把柱等分成若干段，每一段高度等于一块理论板。 理论塔板的计算方法： N---理论塔板数 t R --保留时间 c q K d =2 2/1)(54.5W t N R =2)(16b R W t N =N L H =
生物分离技术复习题
选择题： 1．HPLC是哪种色谱的简称（）。 A．离子交换色谱 B.气相色谱 C.高效液相色谱 D.凝胶色谱 2．针对配基的生物学特异性的蛋白质分离方法是（）。 A.凝胶过滤 B.离子交换层析 C.亲和层析 D.纸层析 3．盐析法沉淀蛋白质的原理是（） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 4．从组织中提取酶时，最理想的结果是（） A.蛋白产量最高 B.酶活力单位数值很大 C.比活力最高 D.Km最小 5．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（）。 A．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 6．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的分析工具是必需的？（） A.该酶的活力高 B.对底物有高度特异亲合性 C.酶能被抑制剂抑制 D.最适温度高 E.酶具有多个亚基 7．用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液的色谱是（） A．离子交换色谱 B.亲和色谱 C.凝胶过滤色谱 D.反相色谱 8．适合小量细胞破碎的方法是（） 高压匀浆法 B.超声破碎法 C.高速珠磨法 D.高压挤压法 9．盐析法沉淀蛋白质的原理是（） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH 到等电点 10．蛋白质分子量的测定可采用（）方法。 A．离子交换层析 B.亲和层析 C.凝胶层析 D.聚酰胺层析 11．基因工程药物分离纯化过程中，细胞收集常采用的方法（） A．盐析 B.超声波 C.膜过滤 D.层析 12．离子交换剂不适用于提取（）物质。 A．抗生素 B.氨基酸 C.有机酸 D.蛋白质 13．人血清清蛋白的等电点为4.64，在PH为7的溶液中将血清蛋白质溶液通电，清蛋白质分子向（） A ：正极移动；B：负极移动；C：不移动；D：不确定。 14．蛋白质具有两性性质主要原因是（） A：蛋白质分子有一个羧基和一个氨基；B：蛋白质分子有多个羧基和氨基；C：蛋白质分子有苯环和羟基；D：以上都对 15．使蛋白质盐析可加入试剂（） A.氯化钠； B.硫酸； C.硝酸汞； D.硫酸铵 16．凝胶色谱分离的依据是（）。 A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小不同 C、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D、各物质与专一分子的亲和力不同 17．非对称膜的支撑层（）。 A、与分离层材料不同 B、影响膜的分离性能 C、只起支撑作用 D、与分离层孔径相同 18．下列哪一项是强酸性阳离子交换树脂的活性交换基团（） A 磺酸基团（-SO3 H） B 羧基-COOH C 酚羟基C6H5OH D 氧乙酸基-OCH2COOH 19．依离子价或水化半径不同，离子交换树脂对不同离子亲和能力不同。树脂对下列离子亲和力排列顺序正确的有（）。 A、Fe3+﹥Ca2+﹥Na+ B、Na+﹥Ca2+﹥Fe3+ C、Na+﹥Rb+﹥Cs+ D、Rb+﹥Cs+﹥Na+ 20．乳化液膜的制备中强烈搅拌（）。
生物分离工程
（最好能有时间过过ppt） 生物分离工程第一章绪论 1.定义：生产粗原料的过程及其之后的目标产物的分离纯化过程，即下游加工过程； 2.下游加工过程：目标产物的分离纯化。包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等 3.特点及其重要性：(1)发酵液或培养液是产物浓度很低的水溶液； (2)培养液是多组分的混合物；(3)生化产物的稳定性差——易引起产物失活；(4)对最终产品的质量要求很高。 4.下游加工过程的一般流程:(1)下游加工过程的一般流程;（2）初步纯化;（3）高度纯化与精制;（4）成品加工 5.分离效率的评价:目标产品的浓缩程度/分离纯化程度/回收率 6.提高回收率的方法：（1）提高每步回收率 ，（2）减少操作步骤；（3）开发新型高效的分离方法 第二章发酵液预处理和固液分离 首先要进行培养液的预处理和固液分离，才能进行后续操作： 对于胞外产物，可先将菌体或其他悬浮杂质去除，才能从澄清的滤液中提取代谢产物。 对于胞内产物，首先富集菌体，再进行细胞破碎和碎片分离，然后提取胞内产物。 1.发酵液的基本特性：发酵产物浓度较低，大多为1-10%； 悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似；固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体，不易过滤；悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动成分复杂，杂质较多。 2.预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度；⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作； ⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）。 3.预处理手段：絮凝与凝聚处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使其聚集起来,增大体积以便固液分离。常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中。其余手段：加热，调节pH。 凝聚：胶体粒子在中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）， 机理：1）中和粒子表面电荷; 2）消除双电层结构;3）破坏水化膜。 胶体双电层结构：发酵液中菌体表面带有负电荷，由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。正离子同时受到使它们均匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表面的趋势。对带负电性菌体的发酵液，高价阳离子的存在，可压缩扩散层的厚度，促使ζ电位迅速降低，而且化合价越高，这种影响越显著。 电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（毫摩尔／升），称为凝聚价或凝聚值。Schulze－Hardy法则（叔采-哈代）：反离子的价数越高，凝聚价越小，即凝聚能力越强。 絮凝：使用絮凝剂（天然和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。絮凝剂主要起架桥作用。机理：架桥作用。 4.加热作用：发酵液预处理最简单最常用的方法。加热能改善发酵液的操作特性。只适用于对热较稳定的液体。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。 5.影响发酵液固液分离的因素：1）发酵液中悬浮粒子的大小； 2）发酵液的黏度viscosity，粘度越大，固液分离越困难。 6.板框压滤机：其过滤推动力来自泵产生的液压或进料贮槽中的气压。1）广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。 2）板框式压滤机在过滤时，悬浮液由离心泵或齿轮泵经滤浆通道打人框内，滤液穿过滤框两侧滤布，沿相邻滤板沟槽流至滤液出口，固体则被截留于框内形成滤饼。滤饼充满滤框后停止过滤。 3）优点：过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。它最重要的特征是通过过滤介质时产生的压力降可以超过0.1MPa,这是真空过滤器无法达到的。 4）缺点：不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。 7.错流过滤原理：液体的流向和滤膜相切。在压力推动下，悬浮液以高速在管状滤膜的内壁作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走，而附着在滤膜上的滤饼很薄，因而能在长时间内保持稳定不变的过滤速度。目前适用于小分子的分离。 特点：收率高（97-98%）、质量好、减少处理步聚、染菌罐也能进行处理、介质阻力大、不能得到干滤饼、需要大的膜面积。
生物物质分离技术
1．发酵液常用的固液分离方法有（离心）和（过滤）等。 2．常用的蛋白质沉析方法有（等电点沉淀），（盐析）和（有机溶剂沉淀）。 3．阳离子交换树脂按照活性基团分类，可分为（强酸型），（弱酸型）和（中等强度）；其典型的活性基团分别有（磺酸基团），（羧基），（磷酸基）。 4．过饱和溶液的形成方式有：（饱和溶液冷却），（部分溶剂蒸发），（化学反应结晶法）和（解析法）。5．蛋白质分离常用的色谱法有（凝胶色谱法），（多糖基离子交换色谱法），（高效液相色谱法）和（亲和色谱法）。 6．为使过滤进行的顺利通常要加入（惰性助滤剂）。 7．离子交换分离操作中，常用的洗脱方法有（pH梯度）和（离子强度（盐）梯度）。 8．阴离子交换树脂按照活性基团分类，可分为（强碱型），（弱碱型）和（中等强度）；其典型的活性基团分别有（季氨基）、（伯、仲、叔氨）、（强弱基团都具备）。 9．多糖基离子交换剂包括（葡聚糖离子交换剂）和（离子交换纤维素）两大类。 10．离子交换树脂由（载体），（活性基团）和（可交换离子）组成。 11．常用的化学细胞破碎方法有（渗透冲击），（酶消化法），（增溶法），（脂溶法）和（碱处理法）。12．DEAE Sepharose是（阴）离子交换树脂，其活性基团是（二乙基氨基乙基）。 13．影响离子交换选择性的因素有（离子化合价），（离子水化半径），（溶液浓度），（离子强度），（溶液的pH值），（有机溶剂），（树脂物理结构）和（辅助力）。 14．CM Sepharose是（阳）离子交换树脂，其活性基团是（羧甲基）。 15．工业离心设备从形式上可分为（管式），（套筒式），（碟片式），等型式。 16．膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为（微滤膜），（超滤膜），（纳滤膜）和（反渗透膜）。 17．工业上常用的超滤装置有（板式），（管式），（螺旋卷式）和（中空纤维式）。 18. 影响吸附的主要因素有（吸附剂的性质），（吸附质的性质），（温度），（溶液pH值），（盐浓度）
(完整版)三微生物分离纯化技术
实验三微生物分离纯化技术 一、目的要求 掌握浇注平板法、平板涂抹法和平板划线法分离微生物的基本原理和具体操作 二、实验材料 1、菌种 2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 3、试剂和仪器：无菌水、无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、水浴锅 2人一组，每人分别用三种方法操作三个培养皿 三、实验原理 平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 浇注平板法和涂布平板法是两种最常用的菌种分离纯化方法，它们不仅可用于分离纯化，还可用于计数等。浇注平板法是将待分离的试样用生理盐水等稀释液作梯度系列稀释后，取其中一合适稀释度的少量菌悬液加至无菌培养皿中，立即倒入融化的固体培养基，经充分混匀后，置室温下培养。最后可从其表面和内层出现的许多单菌落中选取典型代表，将其转移至斜面培养后保存，此即为初步分离的纯种。 涂布平板法是指取少量梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌的涂布棒把菌液均匀地徒步在装个平板表面，经培养后，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典型的代表移接至斜面，经培养后保存。 四、实验过程 （1）稀释平板法 A 每组取培养皿2只，即每个同学做1只。先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。 B 另取一吸管，以无菌操作法吸取10-3或10-4稀释液0.2mL，加在无菌培养皿的一边； C 取已熔化的在水浴锅中保温45－50 ℃左右的培养基，分别倒入上述培养皿中（见图－2），轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于37 ℃恒温培养。 （2）平板涂抹法 A 每组取无菌培养皿2只（每个同学做1只）。在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释
《生物分离与纯化技术》授课教案
《生物分离与纯化技术》授课教案 第一章绪论 教学目的：熟悉生物物质的概念、种类和来源；了解分离纯化技术及其基本原理；熟悉分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；掌握分离纯化的特点与一般步骤；了解生物分离纯化技术的发展历史；熟悉生物分离纯化技术的发展趋势。 教学重点：生物物质的概念、种类和来源；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；分离纯化的特点与一般步骤；生物分离纯化技术的发展趋势。 教学难点：分离纯化技术及其基本原理；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作。教学课时：4 学时 教学方法：多媒体教学 教学内容： 第一节生物分离与纯化的概念与原理 一、生物物质的概念、种类和来源 1. 生物物质：氨基酸及其衍生物类、活性多肽类、蛋白质、酶类、核酸及其降解 物、糖、脂类、动物器官或组织制剂、小动物制剂、菌体制剂 2. 生物物质来源：动物器官与组织、植物器官与组织、微生物及其代谢产物、细胞培养产物、血液、分泌物及其代谢物 二、生物分离纯化概念 指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。 三、生物分离纯化技术
生物技术 上游：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程及组织工程；下游：生物产品的回收——生物分离与纯化技术，主要包括离心技术、细胞破碎技术、萃取技术、固相析出技术、色谱技术和膜分离技术等。 四、分离纯化基本原理 有效识别混合物中不同组分间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质或扩大这些差别的分离设备来实现组分间的分离或目标产物的纯化。
第二节分离纯化策略 一、生物分离纯化技术的特点 1. 环境复杂、分离纯化困难 2. 含量低、工艺复杂
现代生物分离技术及其应用举例
现代生物分离技术及其应用举例生物物质的分离（Bioseparation）是生物工程的一个重要部分。国外文献中，常称之为下游过程（Downstream Process），国内则称之为产品的分离或回收。其目的是把生物反应液，如发酵液或酶反应液内的有用物质分离出来，获得所需的目标成品。 不同的生物产物，其溶解度、分子大小、形状、极性、电荷性质、专一结合位点等理化和生物学性质有或大或小的差异，所以采用适当的分离技术可将其分离纯化。 根据分离过程的基本原理，分离可分机械分离和传质分离两大类。机械分离的对象是非均相物系，是依据物质相态的不同（例如液体、固体），以及依据物质大小、密度的差异进行分离，如过滤、重力沉淀和离心降解等。传质分离的对象主要是均相物系，通常是溶液，可分为速度分离和平衡分离两种。速度分离根据物质溶质在外力作用下产生的移动速度的差异实现分离，亦可称为输送分离，其传质推动力主要有压力差、电位梯度和磁场梯度等，如滤超、反渗透、电渗析、电泳和磁泳等；平衡分离则根据溶质在两相中分配平衡状态的差异实现分离，又称扩散分离法，其传质推动力为偏离平衡态的活度差或浓度差，如蒸馏、蒸发、吸收、萃取、结晶、吸附和离子交换等。对于特定的目标产物，应根据其自身的性质以及共存杂质的特性，选择适宜的分离方法，以
获得最佳分离效果。即在保证目标产物的生物活性不受（或少受）损伤的同时，达到所需的纯度和对回收率的要求，并使回收过程成本最小，以适应大规模工业生产需求。 生物工艺中目前常用的生物分离提纯原理及方法如下表所示： 分离提纯原理分离纯化方法分离对象举例 溶解度的差异 分配系数的差异 分子大小和形状的差异 电荷性质的差异盐析法、等电点沉淀 法、有机溶剂沉淀法、 PEG沉淀法 有机溶剂萃取法、双水 相萃取法、反胶束萃取 法、液膜萃取法、超临 界流体萃取法 离心过滤法、离心沉降 法、超离心法、微滤法、 超滤法、纳滤法、透析 法、凝胶过滤法 离子交换层析法、电泳 法、色谱聚焦法、等电 聚焦法 蛋白质 有机酸、氨基酸、 抗生素、蛋白质、 香料、脂质 菌体、菌体碎片、 细胞、细胞碎片、 蛋白质、核酸、 糖类 蛋白质、氨基酸、 核酸
【实验】微生物的分离与纯化
微生物的实验室培养——自酿葡萄酒中酵母菌的分离与纯化 一、实验目的：掌握无菌技术的操作，尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。 二、实验步骤 （1）制备培养基（马铃薯琼脂培养基）：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（已完成） （2）分离纯化 实验 步骤 操作流程流程叙述操作目的、作用 接种方法一：点燃酒精灯 ↓ 1.灼烧接种 环并冷却 ↓ 2.沾取菌液 ↓ 3.平板划线 ↓ 4.转动培养 皿约70°角 ↓ 5.灼烧并冷 却接种环 ↓ 6.平板划线 ↓ 7．倒置培养 用火柴点燃酒精灯，保证实验操作在酒精 灯火焰进行 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红， 让接种环自然冷却 打开装有菌液的试管，塞子要拿在手上， 将试管口通过火焰灭菌，将冷却的接种环 伸入菌液中，沾取菌液。将试管口通过火 焰灭菌，用塞子塞住试管 左手将皿盖打开一条缝隙；右手把沾有菌 种的接种环迅速伸入平板内，划3到5条 平行线（不要划破培养基），盖上培养皿盖 逆时针旋转培养皿约70°角 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红让接 种环自然冷却 从第一区域划线的末端开始往第二区域划 线，重复以上操作，在三、四、五区域划 线，注意不要将最后一区的划线与 相连。（也可以用连续划“Z”字形线的方 法 倒置培养皿，放入培养箱中培养 避免周围环境中微生物的 污染 清除； 防止杀死菌种 防止塞子被污染； 清除的杂菌 接种到培养基表面 调整角度，准备第二区域 的划线 在琼脂固体培养基表面连 续划线的操作，将聚集的 菌种逐步稀释分散到培养 基的表面 减少培养基内的水分蒸 发，使培养基保持湿润； 防止水珠回流打散菌落 在右图所示 的培养皿内 用笔模拟接 种环画出两 种平板划线 法的划线轨 迹 接种 方法 二： 1.系列稀 释操作 准备六只试管 ↓ 分别加入4.5mL蒸馏水并灭菌，编号 ↓ 取 mL菌液放入第1支试管并混匀 ↓ 从第1支试管取0.5ml菌液放入第2只试管并 混匀 ↓ 重复步骤，直至最后一支试管 2.涂布平 板操作 滴加100μL菌液到培养基表面 ↓ 引燃涂布器，待酒精燃尽后，冷却8～10s ↓ 把培养皿打开一条缝 ↓ 在培养皿盖内侧进一步冷却涂布器，均匀涂布 菌液，转动培养皿，涂匀 ↓ 盖上皿盖,放置10min ↓ 倒置培养皿，放入培养箱中培养 清除涂布器上的杂菌 使菌液均匀分布在培 养基表面 使液体被充分吸收 结果 观察 观察划线平板和涂布平板上的菌落形态、颜 色、大小，可挑取少量菌落制成临时装片，显 微镜下观察。 对菌落进行初步鉴定 1
(完整word版)生物分离技术题库.docx
生物分离技术 一、名词解释 1．凝聚：在解作用下，破坏胞菌体和蛋白等胶体粒子的分散状，使胶体粒子聚 集的程。 2．分配系数：在一定温度、力下，溶分子分布在两个互不相溶的溶里，达到平衡后，它在两相的度一常数叫分配系数。 3．絮凝：指在某些高分子絮凝存在下，在浮粒子之生架作用而使胶粒形成粗大的絮凝的程 4．萃取程：利用在两个互不相溶的液相中各种分（包括目的物）溶解度的不同，从而达到分离的目的 5．吸附：是利用吸附液体或气体中某一分具有性吸附的能力，使其富集在吸附 表面的程。 6．离子交：利用离子交脂作吸附，将溶液中的待分离分，依据其荷差异， 依靠力吸附在脂上，然后利用合适的洗脱将吸附从脂上洗脱下来，达到分离的目的。 7．助：助是一种具有特殊性能的粉或，它能使某些以的物料得容 易。 8．色技：是一相关分离方法的称，色柱的一般构含有固定相（多孔介）和 流相，根据物在两相的分配行不同（由于和力差异），多次分配（吸附 - 解吸 - 吸附 - 解吸?），达到分离的目的。 9．等点沉淀：体系pH ，使两性解的溶解度下降，析出的操作称等点沉淀。10．膜分离：利用膜的性（孔径大小），以膜的两存在的能量差作推力，由于溶液中各分透膜的迁移率不同而分离的一种技。 11．超界流体：超界流体是状超气液共存的最高力和最高温度下物特有的点 ——界点后的流体。 12．反渗透：在只有溶能通的渗透膜的两，形成大于渗透的力差，就可以使溶生倒流，使溶液达到的效果，种操作成反渗透。 13．膜的差极化：是指但溶透膜，而溶留在膜上，因而使膜面度增大，并高于主 体中度。
14．盐析：是利用不同物质在高浓度的盐溶液中溶解度的差异，向溶液中加入一定量的中性盐，使原溶解的物质沉淀析出的分离技术。 15．反相色谱：是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 16．亲和层析：是利用生物活性物质之间的专一亲和吸附作用而进行的层析方法。是近年来发展的纯化酶和其他高分子的一种特殊的层析技术。 二、选择 1． HPLC是哪种色谱的简称（C）。 A．离子交换色谱 B.气相色谱 C. 高效液相色谱 D. 凝胶色谱 2．针对配基的生物学特异性的蛋白质分离方法是（ C ）。 A. 凝胶过滤 B.离子交换层析 C. 亲和层析 D.纸层析 3．盐析法沉淀蛋白质的原理是（B） A. 降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C. 与蛋白质结合成不溶性蛋白 D. 调节蛋白质溶液pH 到等电点 4．从组织中提取酶时，最理想的结果是（C） A. 蛋白产量最高 B.酶活力单位数值很大 C. 比活力最高 D.Km 最小 5．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（B）。 A．活性炭 B.氧化铝 C. 硅胶 D. 磷酸钙 6．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的分析工具是必需的？（B） A. 该酶的活力高 B.对底物有高度特异亲合性 C. 酶能被抑制剂抑制 D.最适温度高 E. 酶具有多个亚基 7．用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液的色谱是（C） A．离子交换色谱 B.亲和色谱 C. 凝胶过滤色谱 D. 反相色谱 8．盐析法沉淀蛋白质的原理是（B） A. 降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C. 与蛋白质结合成不溶性蛋白 D. 调节蛋白质溶液pH 到等电点 9．蛋白质分子量的测定可采用（C）方法。 A．离子交换层析 B.亲和层析 C. 凝胶层析 D.聚酰胺层析 10．氨基酸的结晶纯化是根据氨基酸的（A）性质。
表面活性剂在细胞破碎的应用
学校代码：__11059__学号：1302021035 Hefei University 下游处理技术 XIAYOUC HULIJIS HUZONGS HU 论文题目：表面活性剂在细胞破碎的应用 学位类别：本科 学科专业：生物技术 作者姓名：刘壮 导师姓名：于宙 完成时间：2016.4.29
表面活性剂在细胞破碎的应用 摘要 表面活性剂的结构中有一个亲水基团，通常是离子；一个疏水基团，通常是烃基。表面活性剂的结构特性赋予了其既能和水也能和脂类作用的特性。表面活性剂是一类具有表面活性的物质，溶于溶液后，能显著降低液体表面张力，并能改变溶液的增溶能力。细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，同时也含有蛋白质和脂质。用表面活性剂处理后可增大细胞壁的通透性[1]，这就是表面活性剂在细胞壁的破碎的原理。而细胞破碎是提取胞内产物的必由之路。本文将重点讲述表面活性剂在细胞破碎的应用。 关键词：表面活性剂；cmc；原理 沿革 在工业生产中有些目标产物不再发酵液中，而在生物体中，尤其是基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分分泌到发酵液中，而是在细胞内乘积。脂类物质和一些抗生素也是包含在细菌体中。这时就需要进行细胞破碎。 细胞破碎的方法很多，但是他们适用的范围和破碎效率不同。许多方法仅适合与实验室和小规模破碎。目前工业上生产应用最广泛的是高压匀浆法和珠磨法，由于他们处理量大，速度非常快而备受青睐。但是由于消耗机械能而产生大量的热量，使料液温度升高，容易造成生物活性的丧失容易造成活性物质的破坏[2]。化学方法如增溶法，通过添加表面活性剂，溶解细胞壁的脂，造成细胞壁通透性的改变，从而达到细胞破碎的目的。通过添加表面活性剂要比上述两种方法相对温和。表面活性剂处理制成细胞悬液后可用离心分离除去细胞碎片，在用其他方法如吸附柱或萃取剂分离制得产品。
生物分离工程总结2
1，生物分离工程：是指从发酵液，酶反应液或动植物细胞培养液中分离，纯化生物产品的过程。它描述了生物产品的分离，纯化过程的原理，方法和设备，因为它处于整个生物产品生产过程的后端，所以也称为生物工程下游技术。2，凝集：通过加入无机盐，在无机盐作用下，发酵液中的胶体脱稳并使粒子相互凝集成块状絮凝体的过程。3，絮凝：指某些高分子絮凝剂能在悬浮粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团的过程。4，离心分离：是指在离心场的作用下，将悬浮液中的固相和液相加以分离的方法。5，过滤：发酵液通过一种多孔介质，固体颗粒被截留的过程。6，滤饼过滤：固体颗粒沉积于过滤介质表面形成滤渣层。7，深层过滤：固体颗粒进入并沉积于多孔孔道内，溶液经孔道缝隙流过滤渣。8，细胞破碎：是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质的基础。9，机械破碎法：通过机械运动产生的剪切力使组织细胞破碎。10，物理破碎法：通过各种物理因素作用，使组织细胞的外层结构破坏，使细胞破碎。生物分离工程（下游加工过程）11，化学破碎法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使组织细胞的外层结构破坏，使细胞破碎。12，通过细胞本身酶系或外加酶催化剂的催化作用，使外层结构破坏。13，超声破碎法：在超声波作用下，液体发生空化作用，空穴的形成，增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。14，空化作用：指存在于液体中的微气核空化泡在声波作用下发生变化，声压达到一定值，在声波纵向传插负压区，空泡化增大，在声波传播的正压区，空泡闭合，在反复增大，闭合中，空泡化崩溃，崩溃的瞬间，产生巨大的剪切力。15，酶解法：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。16，酶解—自溶作用：利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需要外加其他酶。17，自溶作用：改变其生长环境，可诱发产生过剩的这种酶或激发产生其他的自溶酶，以达到自溶作用。18，包含体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白，菌体蛋白等。目标蛋白的一级结构是正确的但立体结构是错误的，所以没有生物活性。19，沉淀：是指溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，生成无定形固体从溶液中析出的过程。20，盐析法：蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，以至于从溶液中沉淀出来的方法。21，等电点沉淀法：利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀。22，萃取：利用溶质在互不相溶的溶解度不同，用一种溶剂把溶质从它与另一种溶剂所组成的溶液中提取出来的方法。23，分配定律：在恒温恒压下，溶质在互不相溶的；两相中分配，达到分配平衡后，如果其在两相中的相对分子质量相等，则其在两相中的平衡浓度之比为一常数，称为分配系数k。k=a/c2=萃取相中的浓度/翠余相的浓度。24，超临界流体：是指物质处于其临界温度和临界压力以上而形成的一种特殊状态的流体。25，超临界流体萃取：也叫气体萃取，流体萃取，稠密气体萃取或蒸馏萃取。作为一种分离过程的开发和应用，是基于一种溶剂对固体和液体的萃取能力和选择性在超临界状态下较之在常温常压下可获得极大的提高。它是利用超临界流体，即温度和压力略超过或靠近临界温度和临界压力，介于气体和液体之间的流体，作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某种高沸点或热敏性成分，以达到分离和纯化的目的。26，膜分离过程：是具有选择透过性的天然或合成薄膜为分离介质，在膜两侧的推动力作用下，原料液体混合物或气体混合物中的某个或某些组分选择性地透过膜，使混合物达到分离，分级，提纯，富集和浓缩的过程。27，水通量：指纯水在一定温度，压力下（,25℃），单位时间，单位膜面积透过的水的量。 28微滤：以压力差为推动力，截留水中粒径在~ 10m之间的颗粒物的膜分离技术。29，超滤：在压力差的驱动下，用可以阻挡不同大小分子的滤板或滤膜将液体过滤的方法。30，纳滤：以压力差为推动力，介于反渗透和超滤之间的截留水中粒径为纳米级颗粒物的一种膜分离技术。
《生物分离工程》复习题(解答版)说课讲解
《生物分离工程》复习题(解答版)
《生物分离工程》复习题 《绪论细胞分离》 1.在细胞分离中，细胞的密度ρS越大，细胞培养液的密度ρL越小，则细胞沉降速率越大。 2.表示离心机分离能力大小的重要指标是 C 。 A.离心沉降速度 B.转数 C.分离因数 D.离心力 3.过滤中推动力要克服的阻力有介质阻力和滤饼阻力，其中滤饼占主导作用。 4.简答：对微生物悬浮液的分离（过滤分离），为什么要缓慢增加操作压力？ 5.判断并改错：在恒压过滤中，过滤速率会保持恒定。（×）改：不断下降。 6.简答：提高过滤效率的手段有哪些? 7.判断并改错：生长速率高的细胞比生长速率低的细胞更难破碎。(×)改：更易破碎。 8.简答：采用哪种方法破碎酵母能达到较高的破碎率？ 9.简答：蛋白质复性收率低的主要原因是什么？ 10.简答：常用的包含体分离和蛋白质复性的工艺路线之一。 11. B 可以提高总回收率。 A.增加操作步骤 B.减少操作步骤 C.缩短操作时间 D.降低每一步的收率 12.重力沉降过程中，固体颗粒不受 C 的作用。 A.重力 B.摩擦力 C.静电力 D.浮力 13.过滤的透过推动力是 D 。 A.渗透压 B.电位差 C.自由扩散 D.压力差 14.在错流过滤中，流动的剪切作用可以 B 。 A.减轻浓度极化，但增加凝胶层的厚度 B.减轻浓度极化，但降低凝胶层的厚度
C.加重浓度极化，但增加凝胶层的厚度 D.加重浓度极化，但降低凝胶层的厚度 15.目前认为包含体的形成是部分折叠的中间态之间 A 相互作用的结果。 A.疏水性 B.亲水性 C.氢键 D.静电 16.判断并改错：原料目标产物的浓度越高，所需的能耗越高，回收成本越大。(×)改：原料目标产物的浓度越低。 17.菌体和动植物细胞的重力沉降操作，采用 D 手段，可以提高沉降速度。 A.调整pH B.加热 C.降温 D.加盐或絮状剂 18.撞击破碎适用于 D 的回收。 A.蛋白质 B.核酸 C.细胞壁 D.细胞器 19.重力沉降过程中，固体颗粒受到重力，浮力，摩擦阻力的作用，当固体匀速下降时，三个力的关系重力=浮力+摩擦阻力。 20.为了提高最终产品的回收率：一是提高每一级的回收率，二是减少操作步骤。 21.评价一个分离过程效率的三个主要标准是：①浓缩程度②分离纯化程度③回收率。 22.区带离心包括差速区带离心和平衡区带离心。 23.差速区带离心的密度梯度中最大密度 B 待分离的目标产物的密度。 A.大于 B.小于 C.等于 D.大于或等于 24.简答：管式和碟片式离心机各自的优缺点。 25.单从细胞直径的角度，细胞越小，所需的压力或剪切力越大，细胞越难破碎。 《沉淀》 1.防止蛋白质沉淀的屏障有蛋白质周围的水化层和双电层。