生物分离技术笔记

生物分离技术

一、概述

1、生物分离技术的基础：生物化学、微生物学、动物、植物细胞工程。

生物分离技术的定位：下游——分离、纯化。（上游：选菌、DNA重组、蛋白质改造；中游：发酵、表达、固化技术）在传统发酵投资中占60%，在DNA和蛋白质精制中占80-90%。

2、发展历史：第一阶段：1950年以前的纯培养技术，以压滤、蒸馏为主。

第二阶段：1950通气培养技术和代谢控制技术（离子交换和电泳）

第三阶段：21世纪，现代生物技术；生物分离工程。

3、分离技术及应用范围：

•沉淀分离：盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性沉淀、非离子聚合物沉淀（PEP）•层析分离：吸附、凝胶、离子交换、疏水、反相、层析、聚焦层析和亲和等

•电泳分离：SDS-PAGE、等电聚焦、2D-电泳、毛细管电泳

•离心分离：低速、高速、超速

•膜分离：透析、微滤、超滤、纳滤、反渗透

•萃取技术（双水相萃取、超临界流体萃取、反胶束萃取）、液膜分离、泡沫分离、结晶技术等。

4、生化分离技术的特点：成分复杂、含量极微、易变性、易破坏、具有经验性和均一性；

易变性主要体现在过酸、过碱、高温、高压、离子强度和重金属离子，较低的温度和洁净的环境才下进行。生化分离方法多采用温和“多阶式”进行，“多层剥皮”的方法，现在有一种新技术“钓鱼法”，利用的是某些分子的特有的专一亲和

．．力。

易破坏：氧化、水解、微生物污染。

由于品种多、难度大，导致成本高，所以需要考虑：产品价格；质量标准；产品与杂质的物化区别；产品流经途径是否合理；不同的分离技术方案经济指标的比较。

主要原理是用机械方法或者混合物外加一定的作用力，使各组分分配到不同的物相中。

5、生化分离的基本步骤：

1）建立分析方法：生化分离过程一旦展开，都应首先建立快速灵敏的分析方法，以保证分离工作的顺利进行，利用生物测定、理化测定或两者的结合。测定方法必须满足特异性、重现性好、准确度高、灵敏度高、时间短。

2）选择提取材料：原则是材料来源丰富、含量高（要考虑收率）、杂质少、成本低；范围包括动物植物微生物。

3）选择提取方法：选定后，要有预处理，再提取。参考第二章。

4）分离纯化方法：见后

5）均一性的鉴定：纯度鉴定主要有层析法、电泳法、超离心法，酶的鉴定还有恒比活的方法。测试方法都是相对的，所以要标明测试方法。

6、生化分离技术方案设计和选择：

0）不容物的去除阶段：过滤或离心。

1）粗化阶段：主要是出去大量的杂质，选择的方法能够满足大规模处理的需要，侧重点在速度和处理量上，一般使用均浆、沉淀技术、膜过滤技术。

2）纯化阶段：主要是进一步出去大量杂质，重点放在分辨率和处理量上，离子交换、凝胶层析在此阶段使用。

3）精制阶段：主要是除去微量杂质，重点是分辨率；采用离子交换和亲和层析技术。

原则：要保证生物活性和化学完整性。

7、发展趋势：

灌柱层析是一种快速纯化技术，POROS填料就是他的体现；膨胀床色谱技术；

高效离子交换剂：中压层析或高压层析使用粒度较小而又一定硬度和分辨率的交换剂。

发展倾向：多种纯化技术的结合（融合技术）；分离技术与发酵工艺的结合（耦合）；新型高效分离材料的开发（分子印迹技术、智能高分子材料）；新型分离技术。

8、生物分离过程的关键技术：过滤、离心、膜分离、萃取、吸附交换、工业色谱、电泳技术、结晶、干燥、蒸馏与精馏技术。

二、预处理

1、样品分离的预提取过程

1）植物组织提取物的制备：

植物中酶的提取必须从含有酚、多酚的植物组织中提取，而大量酚的存在给提取带来了困难。酶、酚在植物组织中处于间隔状态，当植物组织破坏后，酚、酶混合接触，发生反应，反应产物苯醌和单宁酸还会继续与酶蛋白发生反应，这样的过程往往使要提取的目的酶失去活性.

注意：提取液的量一定保证“充分侵入”；搅拌适当；PH值5.5-7

二、动物细胞提取：

1、器官的选择：

在不同的器官中，蛋白的数量是不同的，如心脏容易得到澄清液，而肝脏的核酸和脂肪（包括可溶性蛋白）要多些；刚宰杀的器官要去除脂肪和筋皮，马上放入-10℃的冷库中。

脂肪本身容易氧化酸败，导致变质，还会影响后期纯化。一般的脱脂方法有：人工去除脂肪组织；浸泡在脂溶性的有机溶剂中脱脂；快速高温、快速冷却除油块；油脂分离器。

如果蛋白质存在于亚细胞中，如线粒体，亚细胞分离会很容易，但也会限制蛋白质的量。因此大量提取的可行办法是传统方法均浆化器官。

2、注意事项

1）均浆：在机械力和渗透压的结合作用下，缓冲液中的动物细胞膜很容易被破碎。经过离心、均浆后澄清。肝、肾、心脏、脑都是容易均浆化；纤维化的需要冷冻。

2）缓冲液的选择：中性PH值，适当离子强度（如0.1mol/L的磷酸缓冲液，PH7.0）。在静电力下，有些蛋白会黏附在碎片上，加入0.1mol/L的NaCl会提高蛋白收率。

3）蛋白抑制剂：一般来说，蛋白浓度高，其他蛋白会保护目标蛋白；但是有些目标蛋白更易受蛋白酶的影响，纯度越高，蛋白降解会成为大问题，这完全取决于蛋白和器官的来源。使用蛋白酶抑制剂，在大规模提取时，成本会很高，所以尽量避免。理想情况是，分时段测定目标蛋白是否有可测损失，如果有，采取措施。

4）保护剂的添加：有些蛋白易氧化，需要在提取液中加入0.1mmol/L的二硫赤藓糖醇或0.1mol/L的β巯基乙醇；重金属要加入EDTA。

5）离心条件的选择：相对离心力=1.118×10-5×n2×r;缓冲液：器官=2:1.

6）提取液的澄清：心脏类的有足够的澄清度，但是肾脏、肝、脑等在柱层析之前一定去掉颗粒物。方法首先要考虑高速离心（如果均浆液中有核酸和核蛋白引起黏度增大，而降低沉降速率，需加入聚胺类物质，如精蛋白硫酸盐g/L）；另一种方法是热沉淀。

纯化方案第一个步骤是盐析或有机溶剂沉淀，澄清问题此时可以不用考虑；但是，如果目标蛋白和其他粒子一起在盐析中沉淀，那就必须要先解决澄清问题。

3、处理过程

出冷库解冻切片、绞碎（3mm）送至提取罐