菌种测定方法

（规范性附录）

枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的计数和杂菌率的测定

A.1 原理

每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下，经过合适的培养时间可繁殖成一个肉眼可见的菌落，通过对菌落数量的统计，便可计算出相应样品的单位活菌数。

A.2 培养基

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的三级水或相当纯度的水。

按本标准规定的方法配制培养基或购买商品化的产品。

A.2.1 枯草芽孢杆菌培养基

A.2.1.1 成分

营养琼脂 33g；蒸馏水 1000mL。

A.2.1.2 制法

将33g营养琼脂溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；121℃灭菌20min。

A.2.2 酿酒酵母菌培养基

A.2.2.1 成分

孟加拉红培养基 36.6g；蒸馏水 1000mL。

A.2.2.2 制法

将36.6g孟加拉红培养基溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；121℃灭菌20min。

A.2.3 植物乳杆菌培养基

A.2.3.1 成分

蛋白胨 10g；牛肉膏 10g；酵母提取物 5g；磷酸氢二钾 2g；柠檬酸三铵 2g；乙酸钠 5g；葡萄糖 20g；吐温-80 1mL；七水硫酸镁 0.58g；四水硫酸锰 0.25g；琼脂粉 20g；灭菌碳酸钙 3g；蒸馏水 1000mL。

A.2.3.2 制法

将上述试剂依次溶解于蒸馏水中，七水硫酸镁和四水硫酸锰单独用蒸馏水溶解后混入前述溶液中，最后加入琼脂粉，定容至1000mL；121℃灭菌20min。

A.2.4 麦康凯培养基

A.2.4.1 成分

蛋白胨 17g；脙胨 3g；猪胆盐（或牛、羊胆盐） 5g；氯化钠 5g；琼脂 17g；蒸馏水 1000mL；%结晶紫水溶液 10mL；%中性红水溶液 5mL。

A.2.4.2 制法

A.将蛋白胨、脙胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正。将琼脂加入600mL蒸馏水中，加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。

B.临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。

（注：结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌）

A.3 仪器与设备

A.3.1 超净工作台。

A.3.2 天平：感量：0.01g。

A.3.3 震荡器。

A.3.4 高压灭菌器：≥121℃。

A.3.5 生化培养箱：±1℃。

A.3.6 玻璃培养皿。

A.3.7 移液器：精度为1μL。

A.3.8 显微镜：1000倍。

A.3.9 玻璃或塑料涂布棒。

A.4 样品制备

按GB/T 的规定，采取有代表性的样品200g，按GB/T20195制备试样，装入样品瓶中做好标记后备用。

A.5 测定步骤

A.5.1 样品稀释

准确称取待测样品10g，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成10-1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10-1稀释液1mL移入装有9mL无菌水的试管中，充分混匀即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2菌液1mL移入装有9mL无菌水试管中，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释度菌液，供平板接种用。

A.5.2 涂布

枯草芽孢杆菌用涂布法：每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液，加至直径为9cm的培养基平皿的琼脂培养基表面，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀涂于琼脂表面。每个稀释梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。

酿酒酵母菌用混匀法：每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液1mL，加至直径为9cm平皿中，当培养基冷却至45℃左右(实验中用手触摸温热即可)，在每个培养皿中各倒入约15mL培养基，然后迅速旋动培养皿，使菌悬液与培养基充分混匀，置水平位置静止后使之凝固。每个梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。

植物乳杆菌用混匀法：每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液1mL，加至直径为9cm平皿中，当培养基冷却至45℃左右(实验中用手触摸温热即可)，在每个培养皿中各倒入约15mL培养基，然后迅速旋动培养皿，使菌悬液与培养基充分混匀，置水平位置静止后使之凝固。每个梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。

A.5.3 培养

枯草芽孢杆菌培养基平皿置培养箱内37℃倒置培养17-22h；酿酒酵母菌培养基平皿冷凝后置培养箱内28℃倒置培养48h；植物乳杆菌培养基平皿冷凝后37℃培养箱倒置培养48h，分别观察菌落形态，鉴别后计数。

A.5.4 菌落特征

A.5.4.1 枯草芽孢杆菌：培养基平皿置培养箱内37℃倒置培养24h后，菌落不规则，粗糙，不透明，不闪光，蔓延，污白色。

A.5.4.2 酿酒酵母菌：培养基平皿置培养箱内28℃倒置培养48h后，菌落散布在培养基内部，特征为中间粉红色边缘半透明的凸起实心菌落，边缘较整齐。

A.5.4.3 粪肠球菌：平板培养48h的菌落形态，表面菌落约3毫米宽，凸起，圆，光滑，细密，白色，偶尔浅黄或深黄色；培养基内部菌落呈乳白色不规则散布，边缘不整齐，稍成半球状凸起的实心菌落。

A.5.5 菌落计数

A.5.5.1 结果计算

枯草芽孢杆菌计数：每克样品的活菌数（CFU/g）=菌落平均数×稀释倍数×10。

酿酒酵母菌计数：每克样品的活菌数（CFU/g）=菌落平均数×稀释倍数。

粪肠球菌计数：每克样品的活菌数（CFU/g）=菌落平均数×稀释倍数。

A.5.5.2 菌落计数办法

只计算枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和粪肠球菌（特征）的菌落。

当只有一个稀释度，其菌落数在30～300之间时，则以该菌落数乘以稀释倍数。

若有两个稀释度，其菌落数均在30～300之间，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，计算两者的平均数乘以稀释倍数；若大于2则计数其中较小的菌落数乘以稀释倍数。

结果表示：每克样品中的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和粪肠球菌菌数，单位为CFU/g,保留三位有效数字。

A.6 杂菌率

A.6.1 杂菌培养和计数