显微切割技术

显微切割技术
中国医科大学科学实验中心
显微切割技术( 显微切割技术(Microdissection) Microdissection)：是在显微 状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲 选取的材料（组织,细胞群，细胞，细胞内组 分或染色体区带等）进行切割分离并收集用 于后续研究的技术。

显微切割技术实际上属 于在微观领域对研究材料的分离收集技术， 因此应用此技术往往是许多要深入的研究工 作中起始的重要一步。

是一种有效的细胞纯化技术， 是一种有效的细胞纯化技术 ， 可在基本不损伤细 胞内DNA 胞内DNA、 DNA 、RNA和蛋白质并保持组织细胞结构完整的条件 RNA 和蛋白质并保持组织细胞结构完整的条件 下，从组织中分离出同质细胞群 从组织中分离出同质细胞群、 同质细胞群、单个细胞甚至亚细胞 结构。

结构。

技术的必要性： 技术的必要性： 研究对象的异质性 研究对象的异质性 研究材料日趋微小 研究材料日趋微小
基于流式细胞术 流式细胞术的荧光激活细胞分选： 流式细胞术 显微切割是目前从组织或细胞单层分离亚群细 显微切割 胞的有效方法，同时实现将组织中每种细胞群
显微切割技术能够使
作为研究对象，其分子表达谱会非常接近体内 状态 离心技术
我们分离得到特异的 目的细胞，而没有周 围细胞的污染。

显微切割的特点
2“原位”，利用显微切割技术是在组织细胞或染色体的原位取材，
1 “细微”，由于是在显微状态并采用特殊的分 离收集手段，显微切割的对象可以达到微米 级，显微切割的精度可以达到毫微米级，因此 利用显微切割技术可以分离收集到象核仁和包 涵体及染色体特异区带这样细微的对象 。

因此所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。

例如何杰 金氏淋巴瘤中瘤组织成分多样,特征性的瘤细胞(R-S细胞及其变异 型)占细胞成分的2%左右,且呈散在性分布,如果常规地用组织匀浆 的方式从组织中提取蛋白质或核酸，则既包含了来自瘤细胞的成 分，又包含了来自淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细 胞、组织细胞等多种非瘤细胞的成分,这样所提的蛋白质或核酸来 自何种细胞并不清楚，而如果用显微切割技术则可以选择我们需要 的细胞，以使研究对象的历史背景明确 。

组织标本
3“同质”，显微切割技术可以保证所取材料一定层 次上的同质性，例如前面提到的它可以收集CD4或 CD8阳性的同质细胞 4“结合”，显微切割技术可以与多种分子生物学、 免疫学及病理学技术结合使用。

而且如何识别欲 切割的细胞及如何对已切割的细胞进行分析，则 需要和其它方法相结合。

分离纯化
同质细胞群、 同质细胞群、单个细胞、 单个细胞、亚细胞成分
DNA
RNA
蛋白质
DNA水平 DNA水平： 水平：结合测序、 结合测序、RFLP、 RFLP、SSCP、 SSCP、MSP等方 MSP等方 法 , 基因突变、 基因突变 、 染色体易位、 染色体易位、 甲基化改变等 方面的研究。

方面的研究。

RNA水平 RNA水平： 水平：结合Real 结合RealReal-time PCR、 PCR、cDNA芯片等 cDNA芯片等 技术， 技术，基因表达分析。

基因表达分析。

蛋白水平： 蛋白水平 ： 结合western 结合 western blot、 blot 、 2-D 电泳、 电泳 、 蛋白组学方法， 蛋白组学方法，肿瘤研究。

肿瘤研究。

显微切割的材料
显微切割的材料可以是以各种方式贴附于固相支持物 上的各种组织细胞成分，其来源十分广泛，石蜡组织 切片、冰冻组织切片、细胞铺片、细胞爬片、细胞甩 片、培养细胞、常规制备的染色体等均可采用。

具体 选择何种材料根据研究目的的不同进行，如果显微切 割后需要进行RNA分析则通常采用冰冻组织切片或新制 备的细胞片；在回顾性研究中福尔马林固定石蜡包埋 的组织切片应用最为广泛。

影响标本中DNA 影响标本中DNA、 DNA、RNA、 RNA、蛋白质提 取量的因素 样品保存 固定方法 切片厚度 切割效率
普通染色： 普通染色：苏木素， 苏木素，甲基绿等
固定是保证获得高质高量的DNA，RNA和蛋白质最关键的步骤。

固定质 量依赖于固定液穿透组织的时间，固定温度和组织大小。

固定液在组 织中保留时间越长，由于广泛存在的RNA酶或蛋白酶，RNA或蛋白质降 解的就越多。

福尔马林是一种组织学试验室常用的固定液，因为其低 成本和能够快速穿透组织的特点，其缺点是福尔马林和蛋白质之间形 成广泛的交联。

这些交联的分解和变性将产生多肽和蛋白质的片段， 而不是完整蛋白。

因此高质高产量的RNA和蛋白质常规只能由冰冻或 乙醇固定的组织得到。

可逆交联剂的应用可能将成为福尔马林固定的 替代品。

可逆的交联剂如dithiobis (succinimidyl) propionate， 已经成功应用于LCM下游RNA扩增和cDNA的合成。

免疫染色： 免疫染色：是在切割之前进行免疫组化或免疫荧 光染色， 光染色，增强在复杂组织中对目的细胞的鉴别能 力，可以在形态上相似的细胞中选出在免疫表型 上明显不同的细胞， 上明显不同的细胞，如B和T细胞， 细胞，实现对功能分 类后的细胞进行分选。

类后的细胞进行分选。

免疫染色 主要用于研究DNA 主要用于研究DNA和 DNA和RNA 染色过程应注意， 染色过程应注意，使用高亲和力和高浓度的 抗体， 抗体，并尽量缩短免疫染色的时间， 并尽量缩短免疫染色的时间，减少对 DNA和 DNA和RNA的破坏 RNA的破坏。

的破坏。

显微切割的方式
1手动直接显微切割是早期的切割方式，它是 直接在显微镜下手持切割用针分离组织或细胞 群，此种方式切割精度低，只适用于对较大块 组织中的局部区域或细胞群进行分离，切割单 个细胞十分困难。

2机械辅助显微切割是利用普通光学显微镜的微调旋 钮控制切割针切割细胞,可采用30G1/2注射用针替代 需要专用拉丝设备制作的玻璃切割针,此方式切割精 度较手动直接显微切割的精度有了提高，可以达到 对较大的单个细胞的切割，而且此方式简单易行低 耗,尤其适合于基层和无专用设备的单位，但由于显 微镜的微调旋钮只能进行二微控制，对切割后的细 胞进行收集较为困难，且切割精度仍然较低
3液压控制显微切割是采用液压式显微操纵系统配合倒 置显微镜进行显微切割，目前常用的操纵系统有日本 的Narishige和德国的Eppendorf液压显微操纵系统， 该系统同时可用在转基因动物及显微注射等实验中， 它通过液压系统可提供X轴、Y轴和Z轴三个方向的精确 的三微控制，其切割精度是目前各种方式中最高的， 也是很多实验室常用的方法，其不足是不能实现显微 切割的自动化,要收集较大量的目的组分时耗时长，效 率低。

4激光捕获显微切割是目前最为先进的方式,它快速方 便,可从大量的研究材料中迅速捕获较多的目的组分, 自动化程度高,但这需要昂贵的专用设备。

自动识别功能，大大节省切割时间，有效减少降解， 根据细胞的形状、大小、面积、周长，颜色、灰度， 可以设定不同的参数，比如颜色，面积，灰度，周长 等用最少的时间获得最大的切割效率
激光捕获显微分离系统
显微镜 显微镜载物台操纵系 统 CCD摄像 计算机及成像、控制 软件 激光



激光压力弹射(LPC)技术：
在直接光学显微观察的基础 上，利用激光能量对特定的组 织或细胞类型进行切割，同时 用激光脉冲所产生的压力把切 割后的目的样品弹射 (catapult)到收集帽(cap)中 富集起来，从而获得均一性的 样品。

原理
铺片：将待分离样本按常规制备方法，铺在一张附有 薄膜的托片上。

三明治保护结构：将铺有样本的托片翻转后放置在一 张载玻片上，形成三明治保护结构。

样本被保护在膜 和玻片之间，切割时免受外界环境的污染。

放置收集管盖：把一个有一定黏性的Eppendorf管盖 放置在准备好的组织切片的膜上用于切割样品的收 集，同时它还有散射体的作用，能显著提高样本的成 像质量。

选择切割目标：通过CCD摄像机，在屏幕上实时监控待分 离的样本，使用鼠标勾画选择目标细胞或组织，也可将不 同类型的细胞分几组同时勾画出来，即可启动切割


样本切割分离示例
收集切割样品：切割完成后，提起Eppendorf管，由于管 盖具有黏性，切割下来的膜和样本即被黏附在管盖上，至 此完成了显微分离的操作，收集的样品进入后续实验。

全自动显微镜、 全自动显微镜、软件操作 金属卤素光源， 金属卤素光源，激发光强度可调 切割、 切割、收集一体化 目标自动识别 石蜡、 石蜡、冰冻切片、 冰冻切片、活细胞（ 活细胞（贴壁细胞）、 贴壁细胞）、涂 ）、涂 片、甩片、 甩片、树脂包埋组织 6.3x 、20x 、40x切割专用物镜 40x切割专用物镜


主要应用： 主要应用： 从组织切片中获取同质目的细胞 从组织切片中获取同质目的细胞 GFP标记的 GFP标记的活细胞 标记的活细胞筛选 活细胞筛选
工作原理： 工作原理：激光束通过物镜， 激光束通过物镜，由电脑控制沿 着设定好的路径切割， 着设定好的路径切割，即可获得需要的特定 细胞或组织， 细胞或组织，依靠重力作用收集。

依靠重力作用收集。

PEN（polyethylene naphthalate）
6.3x 20 x 40 x
物镜
组织切片 PEN膜 载玻片
激光束 载玻片 PEN膜 组织切片 收集管


GFP（ GFP（green fluorescent protein） protein）标记 的活细胞筛选： 活细胞筛选： 目的： 目的：筛选稳定转染目的基因的细胞群
稳定转染目的基因的细胞： 稳定转染目的基因的细胞：研究某个外源基因对 细胞某些生物学行为（ 细胞某些生物学行为（增殖、 增殖、凋亡、 凋亡、迁移、 迁移、侵 袭）的影响。

的影响。

稳定表达外源基因的肿瘤细胞接种 到动物体内可以直接观察体内成瘤和转移情况， 到动物体内可以直接观察体内成瘤和转移情况， 同时施加一些处理因素， 同时施加一些处理因素，如放化疗、 如放化疗、免疫生物治 疗等对体内肿瘤的疗效。

疗等对体内肿瘤的疗效。

将带有绿色荧光蛋白（ 将带有绿色荧光蛋白（GFP） GFP）标签的质粒载体连接 目的基因， 目的基因，转染进入细胞后， 转染进入细胞后，能够同时表达出GFP 能够同时表达出GFP 和目的基因， 和目的基因，GFP的表达和定位代表目的基因 GFP的表达和定位代表目的基因。

的表达和定位代表目的基因。

目 前GFP已经成为跟踪活组织或细胞内基因表达及蛋 GFP已经成为跟踪活组织或细胞内基因表达及蛋 白定位的常用标记物。

白定位的常用标记物。

表达融合蛋白
GFP
目的 基因
利用LCM 利用LCM系统对活细胞筛选 LCM系统对活细胞筛选， 系统对活细胞筛选，就是将这些 表达GFP 表达GFP（ GFP（代表目的基因） 代表目的基因）的单细胞克隆 逐个挑选出来， 逐个挑选出来，分别培养扩增， 分别培养扩增，最终建立 稳定表达目的基因的细胞系。

稳定表达目的基因的细胞系。

1.接种细胞 1.接种细胞
PEN膜 3.收集 3.收集 2.倒置 2.倒置、 倒置、切割 皿盖
4.转移 4.转移
全景扫描（ 全景扫描（Specimen overview）： overview）：利用电动扫描 ）：利用电动扫描 整个过程可以保证无菌操作 分选得到的细胞克隆准确可靠 一次即可分选出所有阳性克隆 台的精确步进功能， 台的精确步进功能，在高倍视野下（ 在高倍视野下（40× 40×）对一 整块组织按顺序连续扫描， 整块组织按顺序连续扫描，每个镜下视野采集一 张图像， 张图像，形成一个m 形成一个m×n个图片拼接而成的组织全 景图片
可以实现组织切片的电子放大 寻找连续切片的镜下同一位置 计数相似面积内的不同组织切片中结节或阳性 细胞的数量


展望： 展望： 发展单细胞切割技术 更智能的自动识别功能 固定、 固定、染色和抽提方法的改进 用于芯片、 用于芯片、蛋白质组学等高通量分析 激光捕获显微切割技术的广泛应用

。