酵母双杂交ppt

诱饵质粒的构建及表达
•诱饵质粒的构建 •重组质粒转化酵母菌株：醋酸锂法
•融合蛋白表达的检测
➢ 酵母菌体蛋白抽提 ➢ Western Blotting 鉴定
•内源性His3蛋白表达抑制检测
某些诱饵质粒转化酵母菌后会诱导产生内源性组氨酸 3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）：抑制内源性组氨酸产生 通过在培养基中加入3-AT抑制内源性组氨酸产生 选择最佳3-AT浓度，抑制背景表达:
3、确认阳性互作
将无自激活的单个文库质粒和诱饵质粒共转化酵母菌株，涂布于相 应SD平板上
阳性克隆的测序分析
将已验证为阳性克隆的AD质粒测序，通过BLAST进行核 酸序列同源性分析
β-半乳糖苷酶活性定量分析
阳性克隆SD-2中 转接YPAD培养至
30℃培养过夜
OD600=1.0-1.5
加入底物硝基苯半乳糖 （ONPG），30℃显色
Gal4 系统
X
GAL4 DNA-BD
GAL1 UAS
G源自文库L4 AD
Y
promoter
Promoter activation lacZ (or HIS3 etc) reporter gene
Gal4蛋白：酵母菌的转录因子，含有DNA-BD和AD两个部分。DNABD与诱饵蛋白基因X结合，构建BD-X融合表达载体，DNA-AD与靶蛋 白Y结合，构建AD-Y表达载体。两个载体共转化至酵母细胞内，若X 和Y互作，BD和AD空间上接近，激活UAS下游启动子调节的报告基因 表达。
诱饵质粒与AD空载体转化酵母菌，涂布于3-AT浓度梯度 的SD培养基上，观察菌落生长情况
cDNA文库的构建和鉴定
mRNA的制备 合成cDNA第一链 cDNA的LD-PCR的扩增
连接到克隆载体中 转化大肠杆菌
文库质量检测
cDNA插入片断的分析鉴定
一个具有良好代表性cDNA文库应具有106以上的库容量
DNA结合区( Binding domain, BD)：结合UAS
转录激活区 (Activation domain, AD) ：激活转录
这两个功能区是很容易分开的, 可以将一种蛋白质的DNA结合区与另一个蛋白质 的转录激活区融合, 组成一个有活性的杂合蛋白
酵母双杂交系统组成
•与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait) •与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey) •带有一个或多个报告基因的宿主菌株
酵母双杂交技术
酵母双杂交系统的基本原理
activationdom ain D N A b in d in g d o m a in
transcriptionm achinery
UAS
gene
(upstreamactivationsequence)
酵母和其它真核生物中, 转录调控蛋白通常由 2 个独立的结构域组成:
常用系统：
LexA系统 LexA：作为一个DNA-BD结合lexA操纵子。AD是已克隆到特定载体的 异源基因。诱饵蛋白与DNA-BD融合，靶蛋白与AD融合，若两融合蛋 白结合即产生一个新的转录因子，其可识别并结合lexA操纵子的特异位 点，调控报告基因表达。 LexA系统使用的报告基因：lacZ，LEU2
NA2CO3终止反应
Z Buffer洗涤
取上清，测定 420nm下OD值
液氮中冻融3次
β-半乳糖苷酶活性=1000×OD420/（t×V×OD600）
酵母双杂交系统的应用
❖ 验证通过其他方法发现的蛋白质间可能 的相互作用
❖ 确定蛋白质特异相互作用的关键结构域 和氨基酸
❖ 筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异 相互作用的蛋白质
Functions of OsBZR1 and 14-3-3 proteins in brassinosteroid signaling in rice PNAS 2007, 104(34):13839–13844
Gal4 AD
Gal4
a rice cDNA library
full-length OsBZR1
Mutation of the 14-3-3 binding site of OsBZR1 enhances the reporter gene expression in yeast.
The yeast containing GAL4BD-OsBZR1, GAL4BDOsBZR1S156G, and GAL4BD empty vectors were inoculated, with 10-fold dilutions, onto -Trp and -Trp/His drop-out meda with different 3-amino-1,2,4-triazole concentrations and cultured for 4 days.
BD
reporter
Sequences of the putative 14-3-3 binding site inOsBZR1 and its mutagenized version S156G.
Interaction between OsBZR1 and GF14c in yeast two-hybrid assays
文库滴度（pfu/mL）定义为：菌斑数×稀释倍数×1000/铺入平板的稀释的菌溶液体积（μL）
酵母双杂交筛选
单个文库质粒的自激活检测和阳性克隆的进一步确定
1、AD质粒和BD质粒的分离
提取阳性克隆的质粒转化到感受态细胞DH5α，涂布于含Amp的 LB平板上
2、单个AD质粒自激活检测
挑取含Amp的LB平板上生长的单菌落培养，提取质粒DNA，同BD 空载体共转化酵母菌株，涂布于相应SD平板上
Three clones of yeast containing each combination of bait (BD) and prey (AD) vectors were grown on complete medium （+Ade）or Ade drop-out selection medium (+Ade). AD-T7, pGAD-T7 empty vector was used as a negative control.
MATCHMAKER GAIL Two-Hybrid System 3 双杂交系统
酵母菌株
质粒
实验流程
❖ 诱饵质粒的构建及表达 ❖ cDNA文库的构建和鉴定
(猎物载体的构建和表达) ❖ 酵母双杂交筛选 ❖ 单个文库质粒的自激活检测和阳性克隆的进一
步确定 ❖ 阳性克隆的测序分析 ❖ β-半乳糖苷酶活性定量分析