最新-人教版高中生物选修1第专题5课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段(共30张PPT)-PPT文档资料

③延伸
温度上升至720C左右，DNA模板－引物结合物 在Taq DNA聚合酶的作用下以4种脱氧核苷酸 为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原 则合成新的DNA链
3、PCR 循环的结果
①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作 为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的 DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸
②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物 之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈 指数扩增
PCR过程能对最初的DNA进行完整复制吗？
思考:DNA复制4次需要引物几个？ 含引物的DNA有几个？ 不含引物的DNA链有几条？
欲得到含2个引物的DNA至少循环几次？
五、 PCR 的实验操作
（一）设备及用具
3、种类 2种，分别和DNA的两条母链互补配对
（三）缓冲溶液 相当于细胞内的什么成分？ 抵制外界酸碱对溶液pH的影响，维持pH基本 不变，从而保持体外与体内pH一致。 （四） 模板和原料
DNA模板，四种脱氧核苷酸
（五）严格控制温度变化的温控设备
PCR仪
思考:细胞内复制和PCR不同点?
① PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工 合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱 氧核苷酸
2、复制过程
① DNA的解旋
亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶 的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两 条平行的单链
② RNA引物的合成
以单链DNA为模板，在引物酶的作用下合成 小段的RNA引物
③ DNA的生成 以单链的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下， 在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。
②离心目的：使反应液体集中在离心管底部， 提高反应效果
5、反应
将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循 环程序
循环数 变性
复性
延伸
第一次 30次 最后一次
94 ℃ ， 5min
９4℃， 30s
９4℃， 1min
－
－
55℃，30s 72℃， 1min
55℃，30s 72℃， 1min
如果没有PCR仪呢？
可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为94 ℃ 、 55 ℃ 、72 ℃
（三）注意事项 PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的 污染，PCR操作时要注意做到：
①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲 液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；
②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头
六、结果分析与评价 （一）理论上DNA扩增数目的计算
3、Taq DNA聚合酶的应用
体外复制（ 高温）解决了打开双链的问题，但
是高温又导致（
），从Taq
细菌中分D离NA到聚的合（酶失活
）
解决了这个问题，提高了PCR的效率，促成了
PCR技耐术高的温自的动Ta化q DNA聚合酶
（二）引物 1、本质 一小段RNA或DNA，通常为20-30个核苷酸
2、作用 使 DNA聚合酶能从引物的3′端开始连 接脱氧核苷酸
② PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是 通过对反应温度的控制来实现的
③PCR过程中DNA的复制不消耗能量，体内复 制需要ATP供能
四、 PCR的反应过程 1、PCR的反应步骤
PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以 分为三个基本步骤──变性、复性和延伸
循环之前，常进行一次预变性，以增加大分子 模板DNA彻底变性的概率 2、循环过程
①变性（模板DNA解旋）
加热至900C以上（950C），一定时间后双链 DNA解离，成为单链，以便于它与引物结合
②复性（退火）
模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C 左右（ 550C ），2种引物与2条模板DNA单链 的互补序列配对结合
温度降低，引物与模板结合，那么两条母链能 否重新结合呢？
三、 PCR反应的条件
（一）DNA聚合酶 1、特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始 延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物
2、作用过程 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA 链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向 3′端延伸
2条子链的合成起始于DNA的同一端吗？
用微量移液器按照PCR反应体系配方往微 量离心管里面加入各种试剂（每吸取一种 试剂后：盖严微量离心管口的盖子，用手指 轻轻弹击管壁
②注意： A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中 脱落或液体外溢
B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的 是使反应液混合均匀
4、离心 ①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s
④切掉引物生成冈崎片断
在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作 用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为 冈崎片断
⑤ DNA片断的连接
在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形 成一条完整的新的DNA子链。子链与母链构成新 的DNA
二、 PCR(多聚酶链式反应）原理
1、 PCR概念
是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，能以 少量DNA为模板，在几小时内复制出上百万 份的DNA拷贝。
多聚酶链式反应 扩增DNA片段
DNA的羟基末端称为3′端， 磷酸基团的末端称为5′端
脱氧核苷酸结构式
HO
OH 5’
PO
碱基 O
5’
碱基
脱氧核糖
O
3’
HO
O P
5’ O
碱基 O
磷酸基团 碱基
脱氧核糖
O 3’ OH
碱基
多脱氧核苷酸链结构简图
脱氧核糖
3’
一、体内DNA的复制 1、基本条件
原料、模板、酶、ATP
2、 PCR原理
①在80－100°C的温度范围内， DNA的双螺 旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性
②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链 又会重新结合成双链（复性）
③ PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温 度来控制双链的解旋与结合，现在使用的PCR仪 实质上就是一台能够自动调控温度的仪器
1、PCR仪 实质上是一台能够自动调控温度的仪器
2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml
3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上 的一次性吸液枪头用一次更换一次
（二）实验操作步骤
1、准备
按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆 放在实验桌上 （缓冲液和酶，应在-200C储 存，使用前取出放在冰块上缓慢融化） 2、移液