最新-人教版高中生物选修1第专题5课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段(共30张PPT)-PPT文档资料

2、 PCR原理
①在80－100°C的温度范围内， DNA的双螺 旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性
②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链 又会重新结合成双链（复性）
③ PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温 度来控制双链的解旋与结合，现在使用的PCR仪 实质上就是一台能够自动调控温度的仪器
2、复制过程
① DNA的解旋
亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶 的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两 条平行的单链
② RNA引物的合成
以单链DNA为模板，在引物酶的作用下合成 小段的RNA引物
③ DNA的生成 以单链的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下， 在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。
3、Taq DNA聚合酶的应用
体外复制（ 高温）解决了打开双链的问题，但
是高温又导致（
），从Taq
细菌中分D离NA到聚的合（酶失活
）
解决了这个问题，提高了PCR的效率，促成了
PCR技耐术高的温自的动Ta化q DNA聚合酶
（二）引物 1、本质 一小段RNA或DNA，通常为20-30个核苷酸
2、作用 使 DNA聚合酶能从引物的3′端开始连 接脱氧核苷酸
② PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是 通过对反应温度的控制来实现的
③PCR过程中DNA的复制不消耗能量，体内复 制需要ATP供能
四、 PCR的反应过程 1、PCR的反应步骤
PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以 分为三个基本步骤──变性、复性和延伸
循环之前，常进行一次预变性，以增加大分子 模板DNA彻底变性的概率 2、循环过程
多聚酶链式反应 扩增DNA片段
DNA的羟基末端称为3′端， 磷酸基团的末端称为5′端
脱氧核苷酸结构式
HO
OH 5’
PO
碱基 O
5’
碱基
脱氧核糖
O
3’
HO
O P
5’ O
碱基 O
磷酸基团 碱基
脱氧核糖
O 3’ OH
碱基
多脱氧核苷酸链结构简图
脱氧核糖
3’
一、体内DNA的复制 1、基本条件
原料、模板、酶、ATP
用微量移液器按照PCR反应体系配方往微 量离心管里面加入各种试剂（每吸取一种 试剂后，移液器的枪头必须更换）
3、混合
①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指 轻轻弹击管壁
②注意： A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中 脱落或液体外溢
B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的 是使反应液混合均匀
4、离心 ①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s
②离心目的：使反应液体集中在离心管底部， 提高反应效果
5、反应
将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循 环程序
循环数 变性
复性
延伸
第一次 30次 最后一次
94 ℃ ， 5min
９4℃， 30s
９4℃， 1min
－
－
55℃，30s 72℃， 1min
55℃，30s 72℃， 1min
如果没有PCR仪呢？
1、PCR仪 实质上是一台能够自动调控温度的仪器
2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml
3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上 的一次性吸液枪头用一次更换一次
（二）实验操作步骤
1、准备
按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆 放在实验桌上 （缓冲液和酶，应在-200C储 存，使用前取出放在冰块上缓慢融化） 2、移液
②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物 之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈 指数扩增
PCR过程能对最初的DNA进行完整复制吗？
思考:DNA复制4次需要引物几个？ 含引物的DNA有几个？ 不含引物的DNA链有几条？
欲得到含2个引物的DNA至少循环几次？
五、 PCR 的实验操作
（一）设备及用具
④切掉引物生成冈崎片断
在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作 用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为 冈崎片断
⑤ DNA片断的连接
在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形 成一条完整的新的DNA子链。子链与母链构成新 的DNA
二、 PCR(多聚酶链式反应）原理
1、 PCRห้องสมุดไป่ตู้念
是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，能以 少量DNA为模板，在几小时内复制出上百万 份的DNA拷贝。
可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为94 ℃ 、 55 ℃ 、72 ℃
（三）注意事项 PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的 污染，PCR操作时要注意做到：
①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲 液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；
②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头
六、结果分析与评价 （一）理论上DNA扩增数目的计算
①变性（模板DNA解旋）
加热至900C以上（950C），一定时间后双链 DNA解离，成为单链，以便于它与引物结合
②复性（退火）
模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C 左右（ 550C ），2种引物与2条模板DNA单链 的互补序列配对结合
温度降低，引物与模板结合，那么两条母链能 否重新结合呢？
三、 PCR反应的条件
（一）DNA聚合酶 1、特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始 延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物
2、作用过程 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA 链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向 3′端延伸
2条子链的合成起始于DNA的同一端吗？
3、种类 2种，分别和DNA的两条母链互补配对
（三）缓冲溶液 相当于细胞内的什么成分？ 抵制外界酸碱对溶液pH的影响，维持pH基本 不变，从而保持体外与体内pH一致。 （四） 模板和原料
DNA模板，四种脱氧核苷酸
（五）严格控制温度变化的温控设备
PCR仪
思考:细胞内复制和PCR不同点?
① PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工 合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱 氧核苷酸
③延伸
温度上升至720C左右，DNA模板－引物结合物 在Taq DNA聚合酶的作用下以4种脱氧核苷酸 为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原 则合成新的DNA链
3、PCR 循环的结果
①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作 为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的 DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸