生命科学中的分析化学

磷酸腺苷) 的测定,酶活力的测定,吞噬发光与机体免疫功能的测定,血清发光诊断炎症及
肿瘤。发光免疫分析与流动注射结合是测定乙肝病毒表面抗原的有效方法〔11〕。
※光化学分析在生命科学中的应用
☆★荧光分析
荧光分析具有很高的灵敏度和选择性,激光荧光分析可以接近或达到检测灵敏度的 极限—单原子或单分子[12 ] 。利用荧光探针可测定RNA 和DNA ,还可以区分不同构象的 核酸,如区分线状DNA ,环状DNA 及超级线团DNA。荧光分析还是研究DNA 碱基损伤 修复以及与有关药物的化学反应活性部位的理想工具[13 ] 。1987 年美国应用生物化学系 统公司推出了以荧光分析为基础的DNA 序列测定仪,采用电泳分离,荧光标记,实现了 对DNA 的自动分析。采用时间分辩荧光免疫法可鉴定微量血痕种属,灵敏度高,适用于 法医常规检测〔14〕。
计量学的确定,用传统方法需要进行同位素标记合成,费时费力,用ISMS 可在几分钟内
解决问题。类牛胰岛素一I 具有刺激癌细胞生长的功效, ISMS 法为识别癌细胞调节中心 的肽段提供了一种有用的方法。现在的许多新药都是多肽或蛋白,对这些药物的质量检 验是一项较困难的任务, ISMS 法可解决这一难题。
球蛋白在α ,α —联吡啶溶液中可产生极谱波,加入葡萄糖与刀豆球蛋白发生免疫反应,可 用示波极谱法进行测定。采用亚硝化反应吸附溶出伏安法测定衍生化后的雌二醇、雌三 醇、黄体酮等激素,灵敏度可达10 - 10mol·L - 1 。单扫描示波极谱法与免疫反应结合可测 定乙型肝炎表面抗原,灵敏度为0. 5ug. L - 1 。
酸缺失,去保护程序等信息。核苷和核苷酸的分析也可采用等离子体解吸质谱法。
※质谱分析在生命科学中的应用
☆★离子喷雾质谱法( ISMS)
ISMS 可方便地用来测定一种可阻止器官移植后组织排斥的环状肽(cyclosporine) 的 序列,这是用普通仪器很难做到的。ISMS 法还可分析质量非常接近的类蛋白,测定马体 中肌红蛋白(分子量16950. 5dalton) 时,分子量可准确到0. 2dalton ,而且由于灵敏度高,只 需3 ×10 - 15mol 肌红蛋白样品。有关酶和抑制因子体系的共价键、立体专一性以及化学
※质谱分析在生命科学中的应用
☆★快原子轰击质谱(FABMS)
1981 年Barber 创立的FABMS 是分析低分子量肽的有效方法。Barber 研究了蜂毒 素、胰高血糖素、胰岛素B 链、牛胰岛素、人胰岛素原等多肽和蛋白质。若将蛋白质酶解 后进行质谱分析,测定各组份的分子量,再根据酶解选择性确定蛋白质序列结构,最终可 得“肽图”。聚糖、糖苷和糖蛋白的分析比肽的分析难度更大,不仅要求分子量测定和糖基 序列分析,而且还要进行苷键联接点测定和立体化学分析。用FABMS 可分析聚糖的连 接方式,用FABMS/ MS 可测定糖苷的结构,对于糖蛋白的分析,一般是先将蛋白和糖基 分开,再进行FABMS 分析。目前,利用反应质谱法已进行了糖的立体化学分析。
获得了广泛应用。
※质谱分析在生命科学中的应用
☆★反应质谱法(RMS)
RMS 可分析糖及糖苷结构。在质谱仪的离子源中引入立体选择反应试剂—芳基硼 酸,使之与糖发生分子—离子反应,产生特征笼状离子,由其丰度可区分糖的立体异构体。 在离子源中同时加入NaCl 、LiCl ,由产生的加合离子峰可确定糖苷的准分子离子及分子
量,若将糖苷的分子离子引入活化碰撞室,运用MS/ MS 技术可实现一次进样获得苷元结
构鉴定、糖基序列和精确的分子量信息。运用反应质谱法,以α —苯基丁酸酐为立体选择 反应试剂可测定生物碱、氨基酸等的绝对构型,以Me3SiNEt2 为反应试剂可测定甾体激 素的构象,以二卤卡宾可测定烯的构型,以(MeO) 3B 为反应试剂可区别、鉴定邻二醇的苏 式和赤式。
※光化学分析在生命科学中的应用
用阿达玛变换分子荧光法可同时测定单细胞中微量组份的精确含量、分布及三维图
像,可测定单细胞中ng 级的DNA、RNA、蛋白质细胞钙。可进行癌细胞病理研究,对单细
胞核DNA 倍体和形态精确测定,可以预测癌变,确诊癌症并监测治疗效果。 激光诱导荧光光谱在活细胞、活体体液、DNA 碱基序列和细菌病原体的鉴定中发挥 了重要作用,在恶性肿瘤的早期诊断和治疗中已取得了可喜的进展。七十年代发展起来 的流式细胞计就是利用激光诱导荧光光谱法原理设计的细胞定量分析仪器,它可提供生 物细胞的基本信息,从而了解生物物质内在本质变化,在肝细胞倍体以及混合细胞群中各 亚群细胞的DNA 含量的测定、癌细胞动力学研究和化疗癌病患者治疗的监测等方面已
※光化学分析在生命科学中的应用
蛋白质具有天然荧光,利用这种性质检测蛋白质比紫外吸收法灵敏,且没有核酸的干 扰。利用荧光偏振、荧光猝灭及多维荧光检测技术可用来研究蛋白质与配体之间的相互
作用及动力学过程,这对于解释蛋白质的结构与功能的关系及蛋白质与物质或药物的作
用机制具有重要意义。荧光探针在蛋白质研究中也有广泛应用,如染料荧光探针可用于 辨别蛋白质分子中氨基的状态、蛋白质分子的活性区,可检测pmol 级的蛋白质;稀土离子 探针可用于研究蛋白质分子与金属离子结合部位的结构类型,给出蛋白质分子构象及构 象动力学信息。虽然在20 多种氨基酸中,只有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸有天然荧光,但 可用荧光试剂进行衍生化反应,利用荧光分析法测定各种氨基酸,进而测定多肽。荧光免 疫分析采用时间—分辨技术可用于许多蛋白质、激素、病毒抗原及DNA 杂交体的分析。
生命科学中的分析化学
2103级生物取向—王钰珅
※主要内容简介
伏安分析 <1>电化学分析 电化学传感器 反应质谱法(RMS) <2>光化学分析 荧光分析 发光分析
电子喷雾质谱法( ESMS)
<3>质谱分析──→ 快原子轰击质谱(FABMS) 离子喷雾质谱法( ISMS) 等离子体解吸质谱(PIMS) 高效液相色谱(HPLC) <4>色谱分析 毛细管区带电泳(CZE)
水平及原子水平的图像,对研究生物大分子的形貌及变性、失活过程,对揭示生命过程的
本质具有重要意义。
※光化学分析在生命科学中的应用
☆★发光分析
生命活动过程中具有弱发光现象,发光强度与生物体内的某些生化反应具有内在联 系,和环境有相关联系,利用发光分析可研究生命过程,测定生命物质。五十年代起人们 建立了以化学—生物发光为基础的发光分析,并用于微量成份的测定。八十年代起,人们将发 光分析与免疫反应相结合产生了发光生物传感技术,使生物体内的信息在体外获取 成为可能[9 - 10 ] 。九十年代起发光分析开始应用于分子生物学研究,运用发光标记技术制 备基因探针,在基因工程、遗传工程中发挥了重要作用。发光分析的具体应用有:ATP (三
极技术等相结合,在生命科学中已发挥了重要作用。
※电化学分析在生命科学中的应用
▲▼酶传感器~微生物传感器
~免疫传感器
酶传感器是利用酶在生物化学反应中特殊的催化作用,使糖类、尿素、有机酸甚至磷
酸三腺苷(ATP) 等生物分子在常温下分解、氧化,从而检测反应过程中消耗或产生的化学 物质,以测定生物分子。例如,将胆固醇脂酶固定在牛血清蛋白上制成光纤胆固醇传感 器,可测定血清中胆固醇含量〔8〕。酶传感器主要有GPT (谷氨酸丙酮酸转氨酶) 传感器、 胆固醇传感器、胆甾醇传感器、腺苷传感器、尿素传感器等。 微生物传感器是将微生物膜修饰在氧电极或其它电极上组成的传感器,可用于测定 各种微生物。如BOD(生物耗氧量) 传感器,变异原传感器。
免疫传感器是利用抗原与抗体间的专属性反应制备出的高选择性、高灵敏度的传感
器。如HCG(绒毛膜促性腺激素) 传感器可方便地用于怀孕与否的检查,AFP (α —甲胎蛋 白酶) 传感器可用于肝癌诊断。
※电化学分析在生命科学中的应用
▲▼
微电极~化学修饰电极
微电极用作电化学探针,可检测动物脑神经传递物质的扩散过程。在电化学免疫分
直受到很大重视,单克隆及多克隆抗体配基和各种基质键合得到的亲和色谱固定相的研
究已广泛开展,目前已出现以蛋白质为对象的专用色谱柱。
※色谱分析在生命科学中的应用
☆★毛细管区带电泳(CZE)
CZE 由于柱效高(可达到106 板/ m) 、灵敏度高、易自动化,又由于载体可容纳分子量 极大的生物样品(如细菌和病毒颗粒) ,因此在生命科学中有重要应用[24 - 28 ] 。CZE 可分 离人体血清蛋白,可分析人体血红蛋白、同工酶,可分析重组人胰岛素原,可分离血红蛋白 变异株,CZE 与免疫消去法结合还可分析免疫球蛋白。Kim[29 ]用CZE 分析了患有肝硬 化,肾病综合症、多克隆g 病患者的血清,Mat subara〔30〕在CZE 中使用非离子表面活性 剂, 分离了24 种丹磺酰氨基酸。目前已可根据电荷和分子形状的差别分离生物聚合物,测定
※色谱分析在生命科学中的应用
☆★高效液相色谱(HPLC)
色谱分析在生命科学中占有突出地位,HPLC 法分析、分离和纯化生物大分子物质是 目前极为活跃的研究领域[16 - 23 ] 。借助于新的取样技术—微透析,用HPLC 法可直接测 定病人血清中肌肝含量,利用微型柱HPLC 可测定肾上腺素、去肾上腺素,利用非多孔填 料的HPLC 可对各种蛋白质进行分离,利用反相HPLC 可分离核苷酸、核苷、脱氧核苷 酸、脱氧核苷和碱,可测定重组人肿瘤坏死因子衍生物,利用HPLC 法及HPLC —MS 联 用技术用于人体体液中代谢产物的测定也多见报道。HPLC 引入生物技术领域,对生物 工程已产生深远的影响,其描绘生物大分子的分离机理和手性分子分离中的三点作用一
DNA 顺序和DNA 合成中产物的纯度,甚至可进行单个细胞的研究。加入含金属离子的
手性缓冲液,还可进行多肽的手性分离。
~ 结语 ~
分析化学在探讨生命过程、揭示遗传奥秘等生命科学研究中发挥了重要作用,生 命科 学也进一步推动了分析化学的发展。生命功能模拟是分析化学取之不尽的源泉, 仿生化 是分析化学发展的重要方向,生物界所固有的许多功能是分析化学多年来所追求 的目标。 随着电子计算机、信息等科学向分析化学的渗透,分析化学在研究生命科学的过 程中已发 生了深刻的变化。未来的分析化学将不仅是研究生命过程,也是挖掘生命过程有 力的工 具。
析中,用20uL 样品可测定10 - 18mol. L - 1免疫球蛋白- G,采用微电极可将样品量降低至 nL 级,可测量10 - 19 —10 - 20mol. L - 1的物质。 用微电极还可测定单个细胞中的神经递质 化学修饰电极的方法可将生物大分子牢固地固定在单晶基体上,再采用 STM(扫描隧道显微镜) 和AFM(原子力显微镜) 技术,可以在生命的天然或准天然条件 下对生物样品的构型进行不同视野的观察,分别获得接近分子水平、超分子水平、亚分子
※质谱分析在生命科学中的应用
☆★电子离子可准确地、高灵敏地确定高分子量的蛋白质,所测蛋白 的分子量可高达133000dalton (牛血清蛋白二聚体) 。另外,用ESMS 还可鉴定蛋白质的 纯度。
☆★等离子体解吸质谱(PIMS）
PIMS 具有可测量质量范围宽和灵敏度高的优点,适用于多肽和蛋白的分子量测定, 也可研究蛋白翻译后的修饰状况以及在体酶促反应等,还可提供有关合成多肽中的氨基
※电化学分析在生命科学中的应用
☆★伏安分析
伏安分析法可用于测定生物大分子[2 - 6 ] ,利用胆红素、卟啉等与金属离子的配合物 极谱波可测定胆红素、卟啉等。利用线性扫描伏安法可同时测定次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸 等,利用循环伏安法可快速测定肾上腺素、去肾上腺素等,利用差示脉冲伏安法可快速测
定细胞色素C。对于无电活性的氨基酸,可将其与醛反应产生电活性物进行测定。刀豆
※电化学分析在生命科学中的应用
☆★电化学传感器
生物传感器是最高级的传感器,其选择性好、噪声低,在生命科学研究中占有重要地 位。 自1967 年Updike 研制出世界上第一代生物传感器—葡萄糖酶传感器以来[7 ] ,已发 展到第三代生物传感器。 制备的电极有糖、氨基酸、蛋白质、DNA、抗原及抗体、激素及激 素受体、酶免疫、细胞器等生物传感器,这些传感器与流动注射分析、微机处理技术、微电