层析原理与技术

• 按照分子量大小洗脱 • 大分子首先洗脱，最小的分子在最后面 洗脱Baidu Nhomakorabea
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凝胶过滤层析
凝胶的选择
100 Bio-Gel P2 100 Bio-Gel P4 Bio-Gel P6 Bio-Gel P10 Bio-Gel P30 Bio-Gel P60 Bio-Gel P100 800 1,000 1,500 2,500 3,000 5,000 1,000 1,800 4,000 6,000，用于脱盐 20,000 40,000 60,000 100,000 10,000 100,000
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层析原理
Gel Filtration 凝胶过滤
Ion Exchange 离子交换
Hydrophobic Interaction 疏水层析
Affinity 亲和层析
CHT 羟基磷灰石
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凝胶过滤层析 /分子筛
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凝胶过滤
分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固 定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技 术。
Fractions 0.100 100.0% Buffer B 0.090 0.080 0.450 0.400 0.350 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 -0.050 0.500
层析
0.070 0.060 0.050
Chromatography
色谱
• 流动相：在层析过程中，推动固
定相上待分离的物质朝着一个方 向移动的液体等。（柱层析中一 般称为洗脱剂。）
A good gel for gel filtration contains about 95% water 7 2018/10/28
层析方法
凝胶过滤层析 离子交换层析 羟基磷灰石层析 疏水层析 亲和层析
• 1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完 全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开; 建议柱高在80-120cm,直径=H/30
• 2.脱盐
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凝胶过滤层析
凝胶过滤层析的特点：
1. 层析柱规模很大，实验室1.0-2.5×30-100cm，工艺10－20×200cm， 从而设备成本很高；
具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖
、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。
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凝胶过滤
1. Spherical particles packed into a column
2. Sample applied
3. Buffer mobile phase and sample move through column, molecules diffuse in and out of matrix
• 这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而 达到分离
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分离机制
分离机制
• 分子的大小-----凝胶过滤(size-exclusion)（分子筛，分子 排阻） • 分子的电性-----离子交换（IEC）阳离子交换、阴离子交换
• 分子的表面疏水结构-----疏水层析（HIC），反相
Diffusion Buffer Diffusion into the pores Buffer
Diffusion out of the pores
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凝胶过滤层析
分离纯化原理
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Steric exclusion leads to early elution
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50.0
0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 0.0 -0.010
00:00:00 AU
01:00:00 Hr:Min:Sec
02:00:00 Volts
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层析原理
什么是蛋白层析
• 根据蛋白分子物理化学特性的不同而达到分离
– 极性/疏水性：polarity (solubility, volatility) HIC, RP – 离子特性：ionic characteristics (charge) IEX – 大小与形状：size/mass (diffusion, sedimentation) GF – 结构特征与活性位点：shape (ligand binding, affinity) AC
4. large molecules leave the column first followed by smaller molecules in order of size, molecules larger than the matrix pores pass straight through.
层析原理与方法
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内容提要
1、层析原理与技术 2、层析方法 凝胶过滤层析 离子交换层析 羟基磷灰石层析 疏水层析 亲和层析
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层析原理
层析的起源和原理
• 起源----1906年，俄国植物学家Tsweet • 原理----利用物质分配系数不同达到分离 目的
• 其它：羟基磷灰石，金属螯合(IMAC)，亲和，染料配基介质层析 • 精制（polishing）：高分辨率层析
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层析原理 层析的基本概念
流动相
C流出组份 1
固定相
2
3 1 2
3
洗脱峰
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层析原理 层析的基本概念
• 固定相：固定相是层析的一个基
质 ，能与待分离的化合物进行可 逆的吸附，溶解，交换等作用。 （在柱层析中称其为层析填料。） 它对层析的效果起着关键的作用。
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凝胶过滤层析
操作参数选择
柱长的选择
分离：30－120cm 脱盐：30cm以下
洗脱液
离子强度
低 离子作用 排阻作用（0.1-0.5M) 疏水作用 高
pH——中性
流速，根据层析介质的说明，一般很低 样品容量：1－316 ％CV
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凝胶过滤层析
凝胶过滤层析的应用
2. 上样体积少，必须少于柱床体积的3％才能达到较好的分离效果，如果 大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性；