分子遗传学实验3-PCR技术

主要取决于模版DNA的浓度
一般为25-35次
次数过多：扩增效率降低
错误掺入率增加
PCR中应注意的事项
（一）防止污染
试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作
（二）设立对照：
阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分
在进行PCR时，遇到一些问题时的解决办法：
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应
特异性下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少
影响反应产量
（4）dNTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度
过低则降低反应产量
dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度
下降，影响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量
下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP
、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度 。
2）循环参数
(1) 变性
(2) 使双链DNA解链为单链
95oC 20-30秒
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;
降低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸
70-75oC，
延伸时间由扩增片段长度决定
（4）循环次数
PCR 技术的特点
PCR的反应体系和方法
PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板 DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72℃), 在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物 为复制的起点,合成新链。
如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退 火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循 环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样 品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万 倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在 紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的 DNA带。
反应体系
总体积50-100 μl
Buffer 缓冲液
dNTP 原料
Primer 引物
DNA
分子模板
Taq
DNA聚合酶
PCR反应条件
1）PCR 反应成分 （1）模板 ）单、双链 DNA 均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA 聚合酶抑制 剂、 DNA 结合蛋白类。 一般 100ng DNA 模板 /100 100μL。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
⑤减少周期次数；
③从凝胶中回收与所希望的DNA片段大小相同的DNA，进 行再次PCR扩增。
3．凝胶电泳中出现引物二聚体区带 ①检查引物的 3’端是否互补； ②设计较长的引物； ③增加靶目标DNA的量； ④降低引物浓度； ⑤减少周期次数； ③增加退火温度；
4．PCR产物特异性不够 ①增加退火温度； ②减少退火时间及延伸时间； ③降低引物和 Taq DNA聚合酶的浓度 ④改变Mg2+浓度。
1．没有得到所希望的PCR产物 ①确证是否加入酶，检查酶是否有活性；
②DNA解链是否充分； ③人工合成的引物是否正确；
④在未加 Taq DNA聚合酶以前，将反应系统在95℃保温 5～10分钟，使蛋白酶及核酸酶失活。
2．PCR产物在凝胶电泳中呈片状
①减少Taq DNA聚合酶的浓度； ②增加退火温度；
③降低Mg2+浓度； ④减少退火时间及延伸时间；
一、PCR技术简史
•DNA的复制wenku.baidu.com•聚合酶链反应的发明
Kary B. Mullis（1944－）
PCR技术的基本原理
在合适的缓冲体系中,通过加热使模板 DNADNA双链中的氢键断裂形成单链，这 个过程称为变性。在合适的温度条件下，特 异性引物与模板DNADNA根据碱基互补的 原则形成双链，这个过程称为退火。在 DNADNA聚合酶的作用下，引物延伸，形 成新的。如此循环往复，经过多个循环后， 模板DNADNA在22个特异性引物之间的序 列就会大量扩增。
是用反向的互补引物来扩增两引物以外的 DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序 列进行扩增。
可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻 接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列 的 全 长 cDNA 的 克 隆 , 扩 增 基 因 文 库 的 插 入 DNA；建立基因组步移文库。
3）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以 上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生 多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存 在或缺失。
PCR技术的主要类型
1、不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引
物和非限制性引物,其最佳比例一般是 0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板
制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究
反向PCR (reverse PCR)
《分子遗传学》
2020/6/13
2
聚合酶链式反应技术
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Polymerase: DNA 聚合酶 Peoples Choice Reaction
聚合酶链式反应
（polymerase chain reaction，PCR）在 模板DNA和4种脱氧核苷酸存在的条件 下，由一对特异性引物限定的靶DNA片 段，经DNA聚合酶催化的体外合成过程 。