HPLC-NMR联用技术及应用

连续流动模式:一般只适用于1H和19F测试。 在洗脱过程中,溶剂组成不断变化,给峰压制 造成一定的困难。一般先采用预实验,将不 同时间出峰情况记录好,具备一定的分离条 件后,再测定一些感兴趣峰的NMR 谱。其优 势在于一次分析可得到所有组分的NMR信 息,但所获得的NMR图谱质量较差。

停止流动模式:即使溶液停留于检测池中进 行测试,当所需要组分的保留时间已知, 或者 HPLC-NMR采用灵敏的在线检测器时, 可以 采用这种方法。在停止流动的模式下,检测 1H谱或二维谱,所NMR谱图质量较好,不过存 在明显的峰展宽, 而且分析时间较长。
HPLC-NMR联用技术
姓名：段奕倩 学号：20138174010
目录
一、前言 二、HPLC-NMR装置
三、HPLC-NMR的技术进展
四、应用示例
一、前言
高效液相色谱是分析复杂有机物、药物和生物大分子等混 合物的一种重要手段,但如果使用通常的检测器如紫外、荧 光、电化学等检测器只能得到非常有限的分子结构信息。 NMR能够提供大量的分子结构信息，但NMR分析方法要 求样品为纯品，对于复杂的混合物，因为NMR信号的互相 覆盖，单纯靠NMR谱则显得无能为力。

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结果与讨论：白藜芦醇低聚氐类化合物是指由白藜芦醇(2) 为单元聚合而成的一类化合物, 到目前为止发现这类化合 物的聚合度最高为六聚体.该类化合物的氢谱具有很强的规 律性.在大量文献的基础上,对此类化合物的氢谱数据进行 了整理,建立了该类化合物的氢谱数据库.

实验采用LC-NMR联用技术,使微量天然混合物中 的主要组分的化学结构及立体结构得到证实,充分 体现了LC-NMR 技术的微量、快速的特点.实践证 明LC-NMR 在结构具有规律性的同类化合物的鉴 定中, 可起到提高工作效率、避免盲目重复劳动 的作用. 在天然产物的提取分离工作中不但有指 导作用, 在某些情况下,还可确定其结构和立体构 型。
2 .NMR灵敏性

NMR的灵敏度大大低于HPLC的其它常规检测器( 如：紫外检测器等)灵敏度，如何解决这个矛盾是 HPLC-NMR技术发展的主要难题之一。高场探头 性能的不断改进，大大提高了NMR的检测灵敏度， 除此外，目前还可采取以下途径：
提 高 灵 敏 度 的 方 法
(1) 利用SPE等方法浓缩样品。

如果在核磁仪器前加上一级色谱分离设备 直接把样品分离后再送入NMR中扫描，就 可以大大简化分析程序，提高样品分析速 度，这就是色谱分离技术与NMR波谱仪结 合并且日趋普及的原因。
二、HPLC-NMR的装置

典型的HPLC—NMR联用装置是由泵、注入阀、色谱柱和紫 外检测器组成LC系统，通过一条2～2 .5m长的特制毛细管 连接到NMR液相探头上。可以将NMR 视为HPLC 的特殊检测 器，其化学位移、积分强度和谱线分裂情况能提供丰富的 定量定性信息。

在对实验初期和放置一段时间后的1H— NMR图谱比较,在1H—NMR图谱中明显一个 峰位高低转化的过程,说明双氢青蒿素在溶 液中存在异构体的转化过程。并由图谱得 出2个异构体的1H—NMR图谱主要在5位－ H于12位－H化学位移δ值有明显的差异。
2.在化学药物中的应用


(1)未知杂质的结构分析 LC-NMR 联用技术在分析未知杂质时，无 需纯品做对照，不产生破坏性，具有专属 性强、快速、准确、精密度好等优点。可 通过LC-MS 进一步获得杂质结构信息。 Pendela 等用HPLC-NMR与HPLC-MS 相结合 研究了红霉素的降解产物。
三、HPLC-NMR技术发展

近年来HPLC-NMR联用技术的迅速发展得益于 NMR波谱仪磁场强度的提高、HPLC-NMR专用探 头的设计及溶剂峰抑制技术的发展等，从而解决 了动态变化、灵敏度及溶剂抑制(尤其是梯度系统) 的问题。
当时该仪器可采用停止流动模式,随后不 久连续流动模式打通,从此以后,随着仪器 设计、磁场强度、流动探头等方面研制 水平的提高与改进,以及有效的压制溶剂 峰的脉冲序列的建立,使得这项技术现在 已广泛应用到实际工作中。
(2)对双氢青蒿素差向异构体转化的研究

刘宁、杨腊虎等通过HPLC—NMR仪对双氢 青蒿素进行分离和测定。在HPLC色谱条件 下所分离而得的2个异构体以工作频率为 500MHz的NMR仪进行分析,用氘代甲醇为溶 剂,并兼作化学位移内标,在室温下对溶解在 氘代甲醇30min后和异构体转化平衡时进行 氢谱检测。






色谱柱:X Terra RPC18（250 mm×4.6 mm， 3.5μm） 温度:25℃ 流动相:乙腈–0.2 mol/L 醋酸铵（pH 7.0）–水 （270∶100∶63，其中一半的水用D2O 取代）， 体积流量1mL/min。 装有电喷雾式离子源（ESI）的LCQ型MS 仪。 NMR :停流模式，600 MHz Varian VNMRS 仪，探 头体积60μL。 在没有纯品对照下鉴定了2 种未知杂质为红霉素A 烯醇醚羧酸和红霉素C 烯醇醚羧酸。

紫外激发: 这种方法主要是利用软件技术, 在 UV 检测到组分峰时, 经过计算将样品组准确 地滞留于检测池中, 并通知NMR 进行采样检 测。
四、HPLC-NMR的应用

HPLC-NMR在药物研究中的应用主要有新药 杂质(副反应产物与降解产物)结构测定、植 物提取物中具生理活性化合物的结构测定、 药物构型研究、药物代谢产物的结构与构 型研究、药物在体液中的毒性与药代动力 学研究以及微生物代谢物研究。

实验内容:a.在核磁共振仪上采集普通的混合物的1H NMR 谱, 内标为TMS,以CD3OD为溶剂,采样时间1.5s,累 加次数为32次. b.在INOVA-500 LC-NMR上,用停止流动的方法采集LCNMR 1H NMR谱及WEGCOSY谱.进样量为25μL,1H NMR谱采样时间为1.5s,累加次数为416.WETGCOSY的 F1, F2 均为60000. 0 Hz, nt = 24, ni= 128, 总采样时间 为1h 7min 37s.
有可能使用氘代试剂作洗脱液， 不必使用溶剂抑制。
采用氘代溶剂,但价格昂贵,适合于μHPLC。
１
２
通过不同频率通道进行多重溶剂峰预饱和
３
脉冲梯度场的相位离散而消除溶剂干扰
4
使用WET序列
4. 操作模式和技术

到目前, HPLC-NMR联用技术检测有5种模式: 连续流动、停止流动、分时止流、收集分 析和紫外激发。
1.在检测植物药有效成分中的应用
（1）对蛇葡萄根的化学成分的研究 王映红、李娜等通过用HPLC—NMR仪对葡萄 科蛇葡萄根的化学成分进行研究。由结果鉴定出其 中主要成分的结构为－白藜芦醇四聚体Vitisin B。
LC-NMR系统： 高效液相色谱仪：Prostar-230 分析柱：Inert sil ODS-3 柱( 250 ×4.6 mm). 流动相：D2O, CH3CN 采用梯度洗脱,其洗脱比例：D2O：CH3CN =57：43(0~ 10 min) 以后逐渐增加乙腈的比例至40分钟时达到D2O：CH3CN= 40：60. 流速：1mL/min 检测器：Varian Prostar-330 二极管振列检测器, 紫外检测波长：280nm. 将2mg混合物样品溶于80μL乙腈和水的混合溶剂中

其次, HPLC-NMR中样品常常是流动的, 这样 流动相会源源不断的流入腔内, 进入NMR检 测范围, 这限制了预饱和之类溶剂峰抑制方 法的使用。

最后, 实验过程中流动相溶剂梯度会引起某 些溶剂峰化学位移的移动。

为了消除NMR波谱仪接收器的动态范围问题 近年来由于毛细管HPLC的发展， , 溶剂质子信号必须加以抑制 ,常用的方法有: 溶剂的消耗量大为减少，实验中
3. 溶剂峰抑制

HPLC的洗脱液往往组分复杂，在使用梯度洗 脱时被测物在流动相中的量很小，大量溶剂 则产生很强的NMR信号。这些强溶剂峰使得 被分析成分的NMR信号变差，且强的溶剂峰 所伴随的13C 卫星峰也会干扰有用信号的观 测。 其次，实验过程中流动相溶剂梯度会引起某 些溶剂峰化学位移的移动。

(2) 提高磁场强度(900 MHz NMR已经商品 化)：核磁谱仪场强的不断升高,从某种程度 上增加了NMR的灵敏度和分辩力.从1987年 第一台600MHz的NMR仪,到现在已经发展到 900MHz了。

(3)降低探头温度(商品化的低温探头)：利 用高温超导薄膜材料而制成的超导低温探 头,当样品温度由温控单元维持时,采用闭环 或开环制冷系统使超导线圈温度降到25K,消 除了谱图的电噪声,相对常规5 mm探头而言, 其潜在灵敏度可以提高8 ～10 倍。国内已 有此类探头使用, 500MHz信噪比达3200∶1, 可达到800MHz水平。


图2为HPLC-NMR探头内部构造简图,位于NMR探头底部的 阀用来控制NMR测试是在停流状态下还是在连续流动状态 下进行。 它与普通NMR探头的不同在于这种探头带有一流动腔,探 头底部有两个标准的HPLC联结器作为流动相的入口和出 口。样品在这种探头中不能旋转,无法通过旋转以减小x,y 方向上磁场不均匀性的影响,对NMR的分辩率会有所影响。
(2) 提高磁场强度(900 MHz NMR 已经商品化)。 (3)降低探头温度(商品化的低温 探头)。

(1) 利用SPE等方法浓缩样品：近年发展起来一种 样品预处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术 相结合发展而来，主要用于样品的分离、纯化和 浓缩。要得到高分辩的谱图,溶液中不能有悬浮的 灰尘和纤维。一般情况下用棉花和滤纸把样品直 接过滤到样品管中。测试微量样品时,要带手套处 理样品,以防手指上的微量物质溶在溶液中,否则1H 谱中δ1. 4会出现一个7 Hz裂分的双峰,δ4还有一个 四重峰,可能来自丙氨酸或乳酸。


溶剂峰抑制是HPLC-NMR最关键的技术之一。 为了获得高质量的HPLC-NMR谱, 首先要解 决溶剂峰抑制问题。这一问题虽与液态生 物样品NMR 测量中水峰抑制有些类似, 但有 其自身的特点。

首先,在典型的反相HPLC应用中,一般采用二 元或三元组分混合溶剂作为流动相, 这些流 动相所含有的质子基团会产生比感兴趣信 号大几个数量级的溶剂峰, 这些强溶剂峤使 得被分析成分的NMR 信号变差, 且强的溶剂 峰所伴随的13C卫星峰也会干扰有用信号的 观测。采用氘代有机溶剂作为流动相枞上 来说是可行的, 但由于氘代有机溶剂如 CD3CN 和CD3OH 等一般都非常昂贵, 限制了 其在实际中的应用。
1.LC-NMR的流体匣和探头

LC-NMR内部的核心探测系统是一个U形的流体匣， 这是专门为LC-NMR设计的探头(probe)装置。流 出紫外检测器的组分通过聚四氟乙烯的毛细导管 直接流入流体匣内 ,流体匣中有一鼓起的部分，为 流体匣的测量部位，其直径为 2～4mm，体积为 60～250μL。检测线圈(detection coil)则直接围绕 在该测量部位的外围，这样可以得到最佳的填充 系数 (filing factor ,Φ =Vs / Vc ,Vs 和 Vc 分别代表 样品和 NMR 线圈的体积)，使样品与线圈之间作 用最紧密，大大提高了灵敏度。流体匣出口通常 接入废液瓶或者样品收集器。

传统的NMR探头样品管在一个与测量线圈相连的 玻璃插件内旋转(6.1mm,id)。与此不同，HPLCNMR连接采用了改造了的专用探针，其采用了直 接固定在射频线圈上，使线圈的填充因子 （fillingfactor）接近最佳值。

除了探头方面的改进，随着溶剂峰抑制、 溶剂的选择等、NMR灵敏性提高等方面的 改进，使得LC－NMR在线联机得以实现。

收集分析:色谱洗脱物被预先收集到每个样 品池中样品收集品,然后进行离线的NMR检 测。色谱峰被收集并暂时贮存到不同的毛 细管回路内,由NMR谱仪逐一测定各组分。

分时止流:按一定的时间间隔暂停流动相来 检测NMR谱。这种方法在被检组分没有UV 发色团时尤其适用。通过HPLC NMR谱, 也 可以估计色谱峰的纯度。