第八篇 血清型

五、Hp遗传变异 大量群体资料表明Hp存在许多遗传变异 1、Hp0型 血液中Hp含量太低，用常规方法测不 出，称之为无结合珠蛋白血症。这些个 体并无溶血性疾病
此外，胎儿血液中不易测出Hp，部分新生 儿可测出，4个月的婴儿Hp型别大部分可 测出，个别情况直至15岁以后才能测出。 胎儿及新生儿血中测不出Hp，不能称为 Hp0型，这一点在涉及胎儿及婴幼儿的亲 权鉴定时要注意
Gc的主要生物学功能是结合和转运维生素 D 除上述功能以外，Gc还与血浆中肌动蛋白 的清除有关
Gc与脂类和脂肪酸也有很高的亲和力，能 增强中性粒细胞的化学趋化性
B淋巴细胞和T淋巴细胞亚群中细胞型别差异也 与Gc有关
二、遗传及等位基因命名 1、Gc基因 定位于人类第4号染色体长臂上，属于常 染色体单一位点共显性遗传系统。Gc基因 全长42.4kb，含13个外显子，12个内 含子。 Gc的编码产物为单一肽链组成的糖蛋白， 肽链含458个氨基Байду номын сангаас残基
八、Hp型遗传多态性的法科学应用 Hp在血痕中可以保存相当长的时间，但 由于血痕中过多的血红蛋白可掩盖Hp泳 谱，因而在一定程度上限制了血痕的个 体识别能力
第三节 维生素D结合蛋白
维生素D结合蛋白(DPB)，又称为型特异 性成分（Gc） 一、生化性质和生物学功能 由肝脏合成，分子量为52000－ 58000，等电点为4.8－5.1，稳定性最 高60oC
Hp*2基因第四、第六外显子中的第52 位，第53位与第111位，第112位密码 子也具有Hp*1F和Hp*1S的差别 因此， Hp*2基因可分为Hp*2FF， Hp*2FS， Hp*2SS三个等位基因
珠蛋白基因的多态性会导致珠蛋白本身与 血红蛋白的结合能力、抗氧化能力、人体 内铁的代谢循环和免疫能力发生改变。既 往的研究已经发现，珠蛋白基因的多态性 对疟疾的发生和人体内红细胞溶解有着重 要的意义
六、Hp型的群体遗传学调查结果 亚洲人以HP2-2居多，其次为Hp2－1， 而Hp1－1最少。 高加索人以Hp2－1占优势，其次为 HP2-2。 黑种人群体中Hp1－1频率最高，其次为 Hp2－1
七、Hp型的分型原理及方法 电泳前先使待测样品与血红蛋白形成 Hp－Hb复合物。电泳完后可以利用血红 蛋白的过氧化物酶活性在过氧化氢存在时 使联苯胺氧化成联苯胺蓝，染色
三、 Hp基因 定位于人类第六号染色体的长臂上。包 含编码hpα链和hpβ的Hp基因以及Hp 相关基因Hpr Hp*1基因含5各外显子。 Hp*2基因是 由两条Hp*1DNA链组合而成，其结合 位置分别位于第四和第二内含子，因此 Hp*2基因含7个外显子
Hp*1基因第四个外显子中第52、53位 密码子的不同可将Hp*1基因分为 Hp*1F和Hp*1S（F即fast S即 slow）。 第52位为赖氨酸即快，第53位为谷氨酸 即慢
珠蛋白2-2基因型是疟疾流行地区儿童贫血 的危险因素，从而提示携带Hp2-2基因型 的人体在疟疾引起红细胞溶血后，其珠蛋 白结合游离血红蛋白的能力是下降的。 不同珠蛋白基因型对Hb变化的影响更大
四、Hp型的遗传多态性 采用凝胶电泳技术可将不同个体的Hp分为三 型，即HP1-1、HP2-1和HP2-2 。每个人的表 型可用简单的电泳法加以检验 HP的遗传为常染色体不完全显性，分别由 HP1和HP2两个基因控制。 1-1是HP1/HP1纯合子，1-2是HP1/HP2杂合 子、2-2是HP2/HP2纯合子
典型的印迹实验包括三个步骤： ①蛋白质的电泳分离 ②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上， 用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未 吸附蛋白质区域 ③免疫学检测。 免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直 接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大 地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其 成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
第八章 血清型
【目的要求】 1、掌握 HP、GC、TF的遗传特征 2、熟悉 HP、GC、TF的分型原理 3、了解 血清型的亚型
第一节 概 述
一、血清型的概念
人类某些血清蛋白具有遗传多态性， 表型有个体差异，称为血清型 （serum types）
二、血清型的分类与命名 根据分型原理不同，血清型可以分为两大 类： 1、同种异型遗传标记 是指同一种属不同个体免疫球蛋白抗 原性的差别，可采用特异性抗血清分 型。如免疫球蛋白Gm、Km等
带HP1基因者结合血红蛋白较多，HP2基 因者结合血红蛋白较少，如1-1型平均结合 血红蛋白为118g血红蛋白/L，1-2型为 93g血红蛋白/L，2-2仅为75g血红蛋白 /L。
血清结合珠蛋白含量下降，甚至缺如，主 要见于各种血管内溶血性疾病，如阵发性 睡眠性血红蛋白尿症和吞豆病 中毒性肝炎、肝硬化等肝脏疾患、急慢性炎 症、结核、肿瘤时结合珠蛋白含量会升高。另 外，应用某些激素，如皮质激素和雄性激素后， 也可使结合珠蛋白增高。
普通型可采用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分 型。 Hp亚型则需先纯化样品中地 Hp，再使 Hp组分中的α肽链变性，还原后方能采 用普通电泳或等电聚焦技术进行分型
原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联 剂在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维 网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称 为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经 SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝 胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小， 泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼 不可见（只有在染色后才显出电泳区 带）。
第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离 的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电 压（100V）和大电流（1～2A），通电 45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白 质条带肉眼仍不可见。
三、分型原理 1、免疫学的方法可以用来进行同种异型 遗传标记的分型，以特异性的抗体检 测同种异型抗原，确定遗传标记的型 别。如红细胞被动凝集抑制试验、酶联 免疫分析等
2、在法医学鉴定中应用的血清型多数属于 电泳性质上的多态性，需要采用凝胶电 泳技术分型 其分型原理为：不同表型的蛋白质一级结 构存在差异，分子量和等电点不同，在电 场中的迁移率不同，可依据蛋白谱带位置 进行分型
HP1-1型的电泳谱带呈现单一成分，泳动 最快，靠近正极侧 HP1-2和HP2-2型由多个成分组成，电泳 迁移率较小，其谱带浓度向负极呈逐渐递 减趋势
Hp*1基因的产物由Hp*1F和Hp*1S两 个基因产物组成，这样可以检出6种表现 型，分别是Hp1S－1S、 Hp1S－1F、 Hp1F－1F、 Hp2－1F、 Hp2－1S、 Hp2－2
这类血清型的命名多以抗原所在的肽链名 称加抗原编号组成。 如Glm抗原表示该抗原位于免疫球蛋白 IgG1γ重链上
2、血清蛋白的电泳多态性遗传标记 是指不同个体血清蛋白的电泳特性的差 异。是血清蛋白多肽链中部分肽链或个 别氨基酸不同，引起电泳迁移率发生变 化构成的多态性
这类血清型的命名通常是蛋白的缩写 名称加表示等位基因的数字或字母， 如Hp1－1
对不同表现型的DNA序列分析表明， Gc1F、 Gc1S、 Gc2蛋白的遗传 多态性源自第11号外显子第416位和 第420位两个密码子的变异 Gc1F Gc1S Gc2 416位 天冬氨酸 谷氨酸 天冬氨酸 420位 苏氨酸 苏氨酸 赖氨酸
现已知的等位基因为： Gc*2、Gc*1F、Gc*1S 均为共显性等位基因
Hp0型的基因型为Hpdel/ Hpdel Hp*del为沉默基因，其编码hpα链的基 因片断缺失 Hp*del基因以杂合状态存在时该个体呈 现低结合珠蛋白血症
2、Hp－1M型 又称为修饰表现型2－1，是HP2-1与 HP2-2 之间的过渡型 Hp－1M型的泳谱特点是快泳动带成分比 例增多，而2－2区的线条非常贫弱，有时 易与HP2-1相混淆
3、HpCa型 此型快泳动带比例减少，而2－2区谱带 明显增加，其产生可能是嵌合状态所致， 即一类细胞产生Hp2－2，另一类细胞产 生Hp2－1
4、HpJ－1型 此型的特点是1－1区的电泳带分裂为两 条，负极侧谱带增多 5、HpK－1型 此型的特点是1－1区的电泳带分裂为两 条，其余区域无蛋白带
3、有些血清型在分型之前，样品需经神经 氨酸酶或其他试剂处理，如转铁蛋白分 型。 因为糖蛋白糖侧链的电荷会影响蛋白电 泳迁移率
4、电泳后的血清型谱带的显示可以用普通蛋白 染色、免疫固定或免疫印迹法 蛋白染色操作简便，但谱带无特异性
免疫固定后染色为特异性显色方法，主要 是利用抗原抗体的特异性反应识别特异性 蛋白
第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条 带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的 固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二 抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的 酶反应底物，使区带染色。
几乎任何蛋白质都可用于免疫印迹。免疫 印迹的优势是能分析不能用其他的免疫化 学技术进行研究的蛋白质样品。例如，不 能标记的蛋白质或不溶于温和抽提缓冲液 的蛋白质等
一、Hp的生化性质与生物学功能 由肝脏合成，等电点为4.1－4.2，电泳 属于α2－球蛋白组分。含糖量为18.6％ 其主要功能是与游离血红蛋白结合成稳 定的复合物，并很快被单核-巨噬细胞系 统处理掉，阻止了血红蛋白从肾小球滤 过，避免游离血红蛋白对肾小管的损害
结合珠蛋白是一种血浆糖蛋白，分子量约 为90.000。能与红细胞外血红蛋白(Hb)结 合形成紧密的非共价复合物Hb-Hp。每天降 解的Hb约有10%释入血循环中，成为红细胞 外游离的Hb，Hb与Hp结合成Hb-Hp复合物 后分子量可达155,000，不能透过肾小球，从 而防止游离血红蛋白从肾脏丢失，避免Hb所
等电聚焦技术则依靠不同蛋白分子之间等 电点差异进行分型，分辨率比常规凝胶电 泳高，能够揭示许多普通电泳难以检出的 多态性。如维生素D结合蛋白普通电泳分 为三种表现型，而等电聚焦技术分为六种
等电聚焦电泳原理：
所有的氨基酸均为两性物质，在酸性溶液中带正 电荷，在碱性溶液中带负电荷。 若氨基酸在某一pH值下其净电荷为0，且在电场 中不移动时，称此pH值为它的pI值（等电 点）。 当溶液的pH值低于或高于pI，所有蛋白质分子 所带净电荷为同号，彼此之间有相斥力，不会聚 集。 所以，將pH调到等电点的大小，则大部份 的蛋白质將会沉淀，可以应用在电泳，达到分离 蛋白质混合物的目的，这种方法称为等电聚焦电 泳
溶血性贫血患者血浆结合珠蛋白浓度下 降。由于溶血时大量的Hb释出，Hp与游 离Hb结合成复合物而被肝细胞摄取、清 除。此外，Hp也是一种急性期蛋白，患各
二、Hp的分子结构 是由两条α多肽链和两条β多肽链组成的 四聚体，各型之间只有α链不同，而β链 都相同。α链有α1及α2两种 。而α1又 发现有α1F及α1S两种遗传变异体 。两 种变异体的多肽链只有一个氨基酸的残 基组成不同
HP1-1 由两条hp1α和两条hpβ链组 成；HP2-2 由两条hp2α链和两条hpβ 链组成
人的HP为一种α2-球蛋白，其结构受遗传 控制，其表型有三种，即HP1-1、HP12、和HP2-2。每个人的表型可用简单的 电泳法加以检验。HP的遗传为常染色体不 完全显性，分别由HP1和HP2两个基因控 制。1-1是HP1/HP1纯合子，1-2是 HP1/HP2杂合子、2-2是HP2/HP2纯合 子
6、DNA分型技术也可用于血清型分型。 个体差异的实质是人类基因组编码DNA 的差异
四、法医学意义 自1939年发现血清中Hp的遗传多态性 以来，血清型因分型可靠，个体识别率 高等原因受到法医学的重视，多种血清 型成为亲子鉴定选择的遗传标记
第二节 结合珠蛋白型
结合珠蛋白（haptoglobin，Hp）： 是人血清中能与游离血红蛋白（Hb） 结合的一种a糖蛋白。由三种表现型Hp11,Hp2-1，Hp2-2。受控于Hp座位 上的一对等位基因Hp1和Hp2,呈共显性遗传。