氨基酸类药物的分析最终

红外吸收光谱法（IR）
氨基酸在红外区都有特性图谱，可以通过与标准氨基 酸图谱比较作为氨基酸的鉴别依据。
红外吸收光谱法（IR）
用红外分光光度法进行氨基酸鉴别时，除另 有规定外，通常固体供试品均采用溴化钾 片法，在 400 ～ 667cm-1 范围内测定其吸收 图谱。 所得的吸收图谱各主要吸收峰波长和各吸收 峰间的相互强度关系均应与对照的图谱一 致。
R
O
H O
+ NH3 + CO2 + R C
O
O
O
+ NH3 +
HO O O
N
H
C O
+ H2O
成肽反应 一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基缩合成肽，形
成肽键。
...
旋光性
茚三酮 反应
鉴别 试验
紫外分 光光度法 （UV）
薄层色 谱法 （TLC）
红外吸收 光谱法 （IR）
旋光度
不同氨基酸比旋度不同
非水溶液滴定法
• 【例】电位滴定法测定酪氨酸的含量 P148
电位滴定法是在滴定过程中通过测量电位变化以确定滴定 终点的方法。
优点：1、不需要准确的测量电极电位值 2、其准确度优于直接电位法电位滴定法是靠电极
非水溶液滴定法
• 滴定方法：
★将盛有供试品溶液的烧杯置电磁搅拌器上，侵入电极， 搅拌，并自滴定管中分次滴加滴定液。 ★开始时可每次加入较多量，搅拌，记录电位；至将近终 点前，则应每次加入少量，搅拌，记录电位；至突跃点已 过，仍应继续滴加几次滴定液，并记录电位。 ★然后用坐标纸以点位（E）为纵坐标，以滴定液体积（V） 为横坐标，绘制E-V曲线，以此曲线的陡然上升或下降部 分的中心为滴定终点
紫外分光光度法（UV）
• 这三种氨基酸可以通过紫外 吸收光谱加以鉴别。 • 精密称取酪氨酸、色氨酸、 苯丙氢酸各适量。 • 用水制成每1mL含20μg（色 氨酸）、 40μg（酪氨酸） 、200μg（苯丙氨酸）。 • 在波长230～300nm测定各氨 基酸的吸收光谱，如右图。
1：酪氨酸 2：色氨酸 3：苯丙氨酸。
茚三酮反应
• 当茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应时， 氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧 化碳，水合茚三酮则成还原型水合茚三酮。 然后还原型茚三酮与氨，另一分子茚三酮 进一步缩合生成蓝紫色物，最大吸收值的 波长为570nm。
氨基酸检查：
• 根据《中国药典》有关物质测定
• 利用紫外—可见光度法测定氨基酸纯度。
定氮法——基本原理
3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗 的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质 的含量
(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
定氮法
非水溶液滴定法
• 计算式： • P%=FT(V-V0)/S×100% P%:酪氨酸的百分含量； F:高氯酸的滴定液的浓度正因子； T:高氯酸滴定液（0.1mol/L）对酪氨酸的 滴定度，18.12； S:酪氨酸样品质量； V:供试品消耗的高氯酸滴定液的体积； V0：空白消耗的高氯酸滴定液体积； 每1mL的高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当18.12mg的无水酪氨酸
旋光仪
薄层层析色谱法
紫外分光光度法（UV）
在 20 种天然氨基酸中，只有 酪氨酸、色氨酸和苯丙氨 酸在紫外区有最大吸收。
• 酪 氨 酸 的 max ＝ 275nm 275=1.4x103 • 苯丙氨酸的 max ＝ 257nm 257=2.0x102 • 色 氨 酸 的 max ＝ 280nm 280=5.6x103
酸酯是制备氨基酸的酰胺或酰肼的中间物
NH2 R C H COOH + C2H5OH 干燥，HCl 回流 R NH2 C H COOC2H5 + H2O
• 成酰氯反应 可使氨基酸的羧基活化，使它容易与另一氨基酸的氨
基结合，用于多肽人工合成。
HN R C H 保护基 COOH + PCl5 R HN C H 保护基 COOCI + POCl3 + HCl
定氮法——基本原理
1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成 （NH4)2SO4
2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）
2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中
(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
谷氨酸
Glu
HO
O C
赖氨酸
Lys
H2N ( CH2)4
H C
NH2
COOH
非水溶液滴定法
• 中国药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药物， 除谷氨酸用氢氧化钠为标准溶液的酸碱滴定法，其余均根 据其结构特性，采用了非水酸碱滴定法。 • 用冰醋酸作溶剂，高氯酸作标准溶液滴定，电位法或指示 剂法确定终点。 • 适用于常量氨基酸的含量测定。
其他方法
• 对于多种氨基酸制成的复方制剂中氨基酸的含量测定，可 以采用HPLC或氨基酸自动分析仪进行测定
HPLC
据文献报道，用邻苯二甲醛柱前衍生和荧光检测的反相高效液相 色谱法测定复方氨基酸注射剂中氨基酸含量，检测限为pg水平。
氨基酸自动分析仪法
仪器分析方法也可用于氨基酸的含量测定。
如杜鸣等在荧光计上附加互相垂直的偏振片消除溶 剂散射光的影响和苯丙氨酸的干扰，用偏振荧光光 度法同时测定氨基酸注射液及动植物浸出液中酪氨 酸和色氨酸的含量。
中国药典：每1mL硫酸滴定液（0.05mol/L）相当于6.606mg天冬氨酰
碘量法或溴量法
盐酸半胱氨酸因其分子结构中含有—SH，可用碘量法测定
每1mL碘滴定液相当于15.76mg的C3H7NO2S· HCL
L-胱氨酸因其分子结构中含有—S—S—，可用溴量法测定
每1mL溴酸钾滴定液（0.01667mol/L）相当于2.403mg的C6H12N2O4S2
氨基酸类药物的分 析
2013. 9 .24
组长：王金玉 制作人：王金玉、周睿、张天蔚 演讲：林玉、徐晓岚
Contents
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1
氨基酸及在医药中的应用 氨基酸的鉴别试验 氨基酸药物检查 氨基酸含量测定
2
3 4
• 氨基酸是构成蛋白质的基本 单位，具有高度营养价值的 蛋白质补充剂，有着广泛的 生化作用和临床疗效，可治 疗蛋白质代谢紊乱Βιβλιοθήκη Baidu蛋白质 缺损所引起的一系列疾病的 重要生化药物。
氨基酸含量测定方法
酸碱滴定法
A
非水溶 液滴定法
B 含量测定
E
其他方法
定氮法
C
D
碘量法或溴量 法
酸碱滴定法
• 谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸，其分子结构中均有羧基，故对其原料药 一般采用氢氧化钠滴定液滴定。赖氨酸分子结构有氨基，故可以用酸 碱滴定。 H O COOH HO C CH2 C 天冬氨酸 Asp NH2 H CH2 CH2 C NH2 COOH
• 脱羧基反应
NH2 R C H COOH 脱羧酶 R C H2 NH2 + CO2
一级胺
（3） －氨基 & －羧基 共同参加的反应
茚三酮反应 茚三酮在酸性溶液中与α -氨基酸共热，引起氨基酸氧化
脱氢、脱羧反应，最后生成紫色物质。
O OH OH O
O OH H O HO
COOH
O OH
+ H-C-NH2
烃基化反应
氨基酸氨基中的第一个H原子可被-OH取代，如与2， 4－二硝基氟苯的反应。
形成席夫碱反应 氨基酸的 -氨基能与醛类化合物反应生成弱碱，
即席夫碱。
脱氨基反应
经氨基酸氧化酶催化即脱去-氨基而转化为酮酸。
（2）－羧基 参加的反应
• 成盐和成酯反应 在特定的化学反应中保护羧基，活化氨基。氨基
一：氨基酸 的结构与物化性质
• 1.结构
氨基酸（amino acid）：是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的 有机化合物，氨基一般连在α-碳上。是生物功能大分子蛋白质的 基本组成单位。
氨基酸（amino acid） ——蛋白质的基本结构单元
2.物理性质
• 晶型 α氨基酸为白色晶体，不同氨基 酸其晶体形状不相同。 • 熔点 氨基酸熔点一般在200— 300°C,而且多在溶解时分解。 • 溶解度 均溶于水，但水中溶解度差 别大，能溶解于强酸强碱，不溶于非 极性溶剂。 • 旋光性 除Gly外，所有的天然氨基 酸都有旋光性。 • 构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区 都没有光吸收，在红外区和远紫外区 （λ ＜200nm）都有光吸收.
3.化学性质
－羟基 参加的反应
－氨基 参加的反应
化学性质
－氨基 & －羧基
（1） －氨基参加的反应 • 与亚硝酸反应 Van Slyke（范斯来克 ）法测定氨基酸的基础。
NH2 R C H COOH OH
+
HNO2
R
C H
COOH
+ H2O
+ N2
与酰化试剂反应
氨基的保护试剂。
酰化试剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用作