秀丽隐杆线虫中的RNA干扰
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材料和试剂
1.蠕虫RNAi 克隆/库( Open Biosystems 或者Source BioScience LifeSciences)
2.氨苄西林(IBI Scientific)
3. IPTG (Gold Biotechnology Inc.)
4.LB 琼脂培养基: 琼脂(BD Biosciences), 胰蛋白胨(BD Biosciences), 酵母提取物(BD Biosciences), NaCl (Research Organics Inc.)
5. NGM琼脂
步骤
1. 在含有ampicillin (50 ug/ml) 的LB培养基上（选择性加四环素(1
2.5 ug/ml)）划线可以表达双链RNA的E coli.并培养过夜。
*注意:这里有两种RNA库. 一个是被Vidal和Heuvel 研究组构建并且可以从Open Biosystems公司订购; 另一个是被Julie Ahringer's 研究组构建可以从SourceBioScience LifeSciences公司订购。
2.将细菌转接到只含有ampicilin (100 ug/ml) 的3 ml LB液体培养基中37℃培养过夜。
3.将3 ml 培养液离心并且倒出上清直到剩下150 ul (浓缩到20x). 重悬沉淀.
4.将50 ul 重悬细胞转移到RNAi plate (NGM/IPTG/Ampicillin)的中心. 使它变干(用铝箔纸包好)在室温下诱导过夜(RNAi-接种板可以在用前在室温下保存2-3天。
)
5.在每个板中放10-15个蠕虫卵. 在20 or 25℃条件下孵化2-6 h.吸干净培养液并且在想要的温度下孵化直到得到可以用于将来实验的时期为止。
注意:替代蠕虫卵,用漂白剂同步化蠕虫并且将饥饿的幼虫L1转移到RNAi平板上。
喂食配方
1. RNAi 平板(NGM/IPTG/Ampicillin)
用相同的配方来制做NGM 琼脂培养基但是用终浓度1mM的IPTG和100 ug/ml的氨苄来替代链霉素, 倒入小的培养皿中(35x10 MM).。