白藜芦醇对秀丽隐杆线虫寿命的影响及其初步机制研究

白藜芦醇对秀丽隐杆线虫寿命的影响及其初步机制研究王婷婷;张玉瑶;王吉锡;刘洋;陈永春;姜国华【摘要】Objective:To investigate the effect of resveratrol on longevity ofCaenorhabditis elegans(C.elegans) and its potential mechanism. Methods:Three types ofC.elegans,wild type (N2),daf-2 mutant(e1370) anddaf-16 mutant(mu86) were cultured with different concentrations of resveratrol(0、25、50、100μmol·L-1). The survival rates weremeasured and the effect of resveratrol on life span was recorded. Results:Compared with the DMSO group,significantly extension of the normal life span of three types ofC.elegans(N2,daf-2 anddaf-16 mutants) was observed containing 25、50、100μmol·L-1resveratrol.Conclusion:Resveratrol can extend the life span ofC.elegans,possible not associated withDAF-2/insulin-like signaling pathway.%目的：探讨不同浓度白藜芦醇对秀丽隐杆线虫寿命的影响及其机制。

方法：观察25、50、100μmol·L-1白藜芦醇处理的秀丽隐杆线虫野生型N2与daf-2、daf-16突变体的寿命变化。

结果：与对照组比较，25、50、100μmol·L-1白藜芦醇处理均可以显著延长三种秀丽隐杆线虫的寿命。

结论：白藜芦醇可以显著延长秀丽隐杆线虫的寿命，其对寿命的影响不依赖于DAF-2/胰岛素样信号传导通路。

【期刊名称】《神经药理学报》【年(卷),期】2015(005)005【总页数】6页(P1-6)【关键词】白藜芦醇;秀丽隐杆线虫;寿命;DAF-2/胰岛素样信号传导通路【作者】王婷婷;张玉瑶;王吉锡;刘洋;陈永春;姜国华【作者单位】哈尔滨市儿童医院药剂科，哈尔滨，150010，中国;黑龙江中医药大学基础医学院解剖与组胚学教研室，哈尔滨，150040，中国;黑龙江中医药大学基础医学院解剖与组胚学教研室，哈尔滨，150040，中国;黑龙江中医药大学基础医学院解剖与组胚学教研室，哈尔滨，150040，中国;黑龙江中医药大学基础医学院解剖与组胚学教研室，哈尔滨，150040，中国;黑龙江中医药大学基础医学院解剖与组胚学教研室，哈尔滨，150040，中国【正文语种】中文【中图分类】R964白藜芦醇（resveratrol），化学名为三羟基芪，是一种生物活性极强的天然多酚类物质，主要来源于葡萄、虎杖、花生、桑椹等植物。

近来，白藜芦醇因其多种多样的健康益处受到大众媒体和科学界的普遍关注［1］。

作为一种天然的抗氧化剂，白藜芦醇具有抗癌、抑制肿瘤、抗炎、降脂、降糖等多重功效。

有研究表明，白藜芦醇可清除体内过多氧自由基，有效延缓衰老大鼠氧自由基应激损伤，发挥抗衰老作用［2］，目前已有研究证实白藜芦醇能够延长酵母［3］、非洲齿鲤［4］、果蝇［5］以及线虫［6］等生物体的寿命。

但也有研究认为白藜芦醇对野生型线虫［7］和甲壳类水蚤［8］寿命无明显影响。

为探究白藜芦醇是否具有延寿功效及其可能参与的机制，本研究采用目前国际公认的衰老模式生物——秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans），探讨白藜芦醇的延长寿命的作用和可能的参与调控机制。

1.1 实验材料1.1.1 秀丽隐杆线虫野生型（N2）、daf-2突变体（e1370）、daf-16突变体（mu86）秀丽隐杆线虫，由美国线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）提供。

1.1.2 药品与试剂白藜芦醇，纯度＞98%，购自于中国药品生物制品检定所；蛋白胨（bacto peptone），购自于碧迪医疗器械（上海）有限公司；琼脂糖（agar）、链霉素（streptomycin），均购自于美国Amresco公司；制霉素（nystatin）、5-氟脱氧尿苷（5-fluorodeoxyuridine）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），均购自于美国Sigma公司；异丙基- β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-d-thiogalactoside，IPTG），购自美国Merck公司；胰蛋白胨（tryptone）、酵母提取液（yeast extract），均购自英国OXOID公司。

1.1.3 仪器WV-425-600E超净工作台，美国NUAIR公司；SP-02型生化培养箱，黄山市恒丰医疗器械有限公司；SX-500型高压灭菌器，日本TOMY公司；SMZ-1500型体式光学显微镜，日本Nikon公司。

1.1.4 溶液配制白藜芦醇溶液：配制白藜芦醇母液，溶剂为100%DMSO溶液，保存入4℃冰箱。

实验过程中将各浓度组母液以1∶1 000加入到OP50菌液中，使终浓度为25、50、100 μmol·L-1。

对照组母液为不含白藜芦醇的DMSO溶液。

实验过程中将对照组母液以1∶1 000加入到OP50菌液中。

标准线虫培养基（nematode growth medium，NGM）：含有3.0 g氯化钠，2.5 g蛋白胨，15.0 g琼脂糖以及1 mL胆固醇溶液（5 mg胆固醇溶于1 mL无水乙醇中），去离子水1 000 mL，上述溶液经高压灭菌并降温至60 ℃后，加入25 mL的1.0 mol·L-1磷酸盐缓冲液以及1.0 mol· L-1硫酸镁、1.0 mol·L-1氯化钙、200 mg·mL-1链霉素、10 mg·mL-1制霉素各1 mL，终体积为1 000 mL。

M9缓冲液：氯化钠50 g、磷酸二氢钾30 g、磷酸氢二钠60 g溶于1 000 mL 去离子水中，经高压灭菌并降温至60 ℃后，加入1.0 mol·L-1硫酸镁1 mL。

E.coli OP50菌液：LB溶液（含氯化钠10 g、胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g，溶于1 000 mL去离子水中，高压灭菌）50 mL、200 mg·mL-1链霉素50 μL、OP50菌液原液50 μL相混合，置于37 ℃生化培养箱内孵育12 h，测定吸光度（absorbance，A）值：A600=1.2。

1.2 实验方法1.2.1 实验分组野生型（N2）、daf-2突变体（e1370）、daf-16突变体（mu86）秀丽隐杆线虫分为DMSO溶剂对照组、白藜芦醇低、中、高剂量组（25、50、100 μmol·L-1）。

药物经DMSO溶解，使用时以1∶1 000加入到OP50菌液中稀释到所需浓度。

1.2.2 常规培养［9］野生型（N2）、daf-2突变体（e1370）、daf-16突变体（mu86）秀丽隐杆线虫均接种于NGM培养基（内含大肠埃希菌OP50），20 ℃恒温培养。

1.2.3 线虫同步化处理用M9缓冲液将秀丽隐杆线虫洗脱下来，向收集液中加入1.5 mL消化液（1 mL 次氯酸钠加入0.5 mL的5 nmol·L-1氢氧化钠），混合均匀后静置，重复该步骤直至秀丽隐杆线虫虫体全部消化掉，终体积5 mL。

将该混合液于室温离心（1 300 r·min-1，15 min）。

弃上清，加入1 mL M9缓冲液，重悬后再次离心，重复该步骤2次。

随后将液体移入培养皿中，20 ℃孵化12 h，得到L1期秀丽隐杆线虫幼虫。

将幼虫转移到含有OP50菌的NGM培养基中，20 ℃培养，用于后续实验。

1.2.4 线虫寿命实验同步化后48 h的L4期秀丽隐杆线虫转移到含有0、25、50、100 μmol·L-1白藜芦醇固体NGM培养基中，每浓度组培养3皿，每皿培养30只线虫，置于20 ℃下恒温培养。

每2 d观察各组线虫生存状况，记录死亡条数，直至全部秀丽隐杆线虫死亡。

判定死亡标准：用铂针轻触虫体无任何反应。

1.3 统计学方法所得数据通过GraphPad Prism进行医学统计处理，用Kaplan-Meier法进行生存分析，并由Logrank检验进行寿命统计，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P ＜ 0.05认为差异有显著性。

2.1 不同浓度的白藜芦醇对野生型秀丽隐杆线虫寿命的影响将同步化48 h后的野生型（N2）秀丽隐杆线虫转移入含有25、50、100μmol·L-1白藜芦醇的培养基中后观察发现，25、50、100 μmol·L-1白藜芦醇均可使野生型（N2）秀丽隐杆线虫的生存曲线右移并明显延长线虫寿命（Fig.1）。

25、50、100 μ mol·L-1白藜芦醇组野生型秀丽隐杆线虫平均存活时间分别为（20.8±6.9）d、（22.8±6.2）d和（24.2±7.1）d，较DMSO组（18.6±5.1）d分别延寿达11.99%（P＜ 0.01）、22.98%（P＜ 0.001）、30.08%（P＜0.001）；中位生存期从17 d分别延长到19 d、23 d及23 d（Tab.1）。

2.2 不同浓度的白藜芦醇对秀丽隐杆线虫daf-2、daf-16突变体寿命的影响。

为探究白藜芦醇可能的延寿机制，对秀丽隐杆线虫daf-2、daf-16突变体重复了上述实验，研究结果发现，经同步化后的秀丽隐杆线虫daf-2突变体，经不同浓度的白藜芦醇处理后，其寿命明显延长（Fig.2）。

25、50、100 μmol·L-1白藜芦醇使秀丽隐杆线虫daf-2突变体较DMSO组分别延寿达21.79%（P ＜0.01）、29.23%（P ＜ 0.001）、38.64%（P ＜ 0.001）；中位生存期分别从21 d延长到28 d、28 d及31 d。

其中50、100 μmol·L-1浓度的白藜芦醇给药组秀丽隐杆线虫daf-2突变体最大生存期超过了50 d（Tab.2）。