秀丽隐杆线虫中RNA干扰作用的遗传分析

秀丽隐杆线虫中R N A干扰作用的遗

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秀丽隐杆线虫中RNA干扰作用的遗传分析

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摘要：秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA引起的转录后水平的基因沉默（PTGS）现象，是研究基因功能的一种快速和高通量的方法。本次实验通过饲喂的方法，观察外源RNA分子对秀丽隐杆线虫发育的影响，从而了解RNA干扰的原理、特性及其应用。通过此次实验，我们达到了实验目的，取得了良好的实验效果。

关键词：秀丽隐杆线虫、RNA干扰（RNAi）、饲喂法

1．引言

秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。在理想的条件下（充足食物，20℃）生命周期大约为4d。秀丽隐杆线虫成体长1～，体宽约

70μm，全身透明，以细菌为食，全身共有959个细胞。研究用的通常是秀丽隐杆线虫野生型（N2）。从1965年开始，Sydney Brenner以线虫为材料研究发育和神经生物学，现在已经成为经典模式生物之一。

线虫性别是由常染色体和性染色体组的比例决定，有两种性别形式：雌雄同体和雄虫。雌雄同体的性染色体为XX，而雄虫性染色体为X0。雌雄同体的秀丽隐杆线虫既产生卵，又产生精子，可以与雄体交配，也可以自体受精进行繁殖，但雌雄同体之间不能异体受精。在雌雄同体自交繁殖中以%的频率产生雄体（是减数分裂时性染色体不分开造成的）；而雄体与雌雄同体交配其后代两种性别比例为1:1。

线虫有单基因突变形成的表型，例如：运动不协调（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成这些表型的基因有很多个，分别分布于各条染色体上。这些易于观察的表型作为遗传标记，给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利。此外，线虫还有许多组织特异性标记的品系。

秀丽隐杆线虫的生命周期很短，20℃仅需4d。卵在通过受精囊时受精形成一层坚硬的几丁质的外壳，在母体内就开始分裂。从母体产出的卵大约处于30个细胞期。胚胎发生很有规律，从卵中孵化出约有550个细胞的幼虫。从孵化到成体，线虫经历4个幼虫阶段（L1～L4）和4次蜕皮，在身体大小和细胞数目两方面都有增长。蜕皮的时间（20℃）分别是孵化后13、、和41h；身体长度分别是350、470、640和890μm。秀丽隐杆线虫孵化后约50h开始产卵，每个雌雄同体可产200到300卵。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA引起的转录后水平的基因沉默（PTGS）现象，是研究基因功能的一种快速和高通量的方法。

目前，在线虫中发展出3种不同的RNAi实验操作方法：① 注射（injection）dsRNA；②将线虫浸泡（soaking）于一定浓度的dsRNA溶液中；

③ 用表达dsRNA的工程菌（）饲养（feeding）线虫。这3种方法各有优缺点，其中饲养法简单易行，适合高通量的基因功能筛选研究，已有用此方法对线虫全基因组进行筛选的报道。

此次实验培养出RNAi型秀丽隐杆线虫的整体步骤是：提取秀丽隐杆线虫总RNA反转录合成cDNA，cDNA经过RT-PCR产生Gene，Gene经过双酶切产生Gene片段。另外L4440质粒双酶切形成线性L4440质粒。Gene片段与线性

L4440质粒经过T4 DNA连接酶连接形成L4440质粒-Gene，L4440质粒-Gene转入到HT115（DE3）中进行阳性克隆。阳性克隆后进行PCR鉴定。之后将阳性克隆产物进行IPTG诱导形成Gene-dsRNA，将其通过饲喂法导入到秀丽隐杆线虫，能产生对目的基因表达和功能的特异性干扰，从而培养出RNAi型秀丽隐杆线虫。

2．材料和方法

材料、试剂和器材

实验材料：秀丽隐杆线虫野生型（N2）、大肠杆菌OP50、大肠杆菌HT115（DE3）、6种不同的RNA干扰菌株HT115（含有能表达不同gene dsRNA的质粒，对应的性状编号分别为：bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2、lon）实验试剂：LB液体培养基、NGM固体培养基

实验器材：实体显微镜、显微镜、粘虫器（pick）、培养皿、锥形瓶、微量移液器、蓝枪头、黄枪头、白枪头、记号笔、酒精灯、火柴、高压蒸汽灭菌锅、封口膜

方法

活化大肠杆菌OP50

打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。取一个灭菌后的15mL离心管，用微量移液器向其加入3mL LB液体培养基，再向其中加入300μL大肠杆菌OP50。将15mL离心管放入37℃恒温摇床中振荡培养过夜（8～12h）。

大肠杆菌OP50涂平板

大肠杆菌OP50振荡培养过夜后，打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。用微量移液器取200μL菌液加入到NGM培养基平板中，轻微转动平板使菌液散开，用封口膜将平板封口。将接种后的平板置于37℃恒温培养箱中培养6～7小时。

向NGM培养基平板中接种线虫

从老师提供的线虫培养板中选取有卵的或者L1、L2期雌雄同体线虫（生长时期保证一致），用粘虫器（pick）挑取这些线虫接种到NGM培养基平板中，用封口膜将平板封口。记录接种的线虫所处的生长时期和接种时间，根据线虫生长时期与温度的关系与自己的实际时间情况合理确定线虫培养方案，选择在不同温度的恒温培养箱（20℃和25℃）中的培养时间，将线虫培养至第四幼虫期（L4期线虫）。

活化干扰菌株和涂干扰板

在步骤进行的期间，要进行活化干扰菌株和涂干扰板。打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。取7个灭菌后的15mL离心管，用微量移液器向其中加入3mL LB液体培养基和3μL Amp，再分别加入300μL bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2和lon6种干扰菌株以及阴性对照HT115菌株，用微量移液器吹吸混匀。将这7个15mL离心管做好标记，放入37℃恒温摇床中振荡培养过夜（12～16h）。之后取7个NGM培养基平板，在超净工作台中，用微量移液器分别取200～300μL 7种活化好的菌液加入到NGM培养基平板中，轻微转动平板使菌液散开，用封口膜将平板封口，在平板的皿底和皿盖