秀丽隐杆线虫中RNA干扰作用的遗传分析
神奇的模式生物—秀丽隐杆线虫
神奇的模式生物—秀丽隐杆线虫摘要：本文对秀丽隐杆线虫的模式生物一般特征入手，介绍了线虫形态学、生物学特征和繁殖、基因组和遗传学等方面的内容。
关键词：秀丽隐杆线虫模式生物基因组最近，秀丽隐杆线虫用于生物实验材料倍受科学家们的关注。
进入21世纪以来，已经有六位科学家利用秀丽隐杆线虫为实验材料揭开了生命科学领域的重大秘密而获得了诺贝尔奖。
1974年英国科学家悉尼·布雷内（Sydney Brenner）第一次把秀丽隐杆线虫作为模式生物，成功地分离出线虫的各种突变体，发现了在器官发育过程中的基因规则而获得了2002年诺贝尔生理学或医学奖。
与悉尼·布雷内共同分享诺贝尔奖的有两名科学家，其中一位科学家是英国约翰·苏尔斯顿（John E. Sulston），通过显微镜活体观察线虫的胚胎发育和细胞迁移途径，于1983年完成线虫从受精卵到成体的细胞谱系。
另一位科学家是美国的罗伯特·霍维茨（H. Robert Horvitz），是利用秀丽隐杆线虫作为研究对象进行了“细胞程序性死亡”研究。
克雷格·梅洛（Craig C. Mello）和安德鲁·菲尔和（Andrew Z. Fire）利用秀丽隐杆线虫实验发现一种全新的基因调控方式—RNA干扰（RNAi）而获得2006年诺贝尔生理学或医学奖。
此外，Martin Chalfie证明了GFP(绿色荧光蛋白)作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。
在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色，由此获得了2008年化学奖。
究竟什么原因使秀丽隐杆线虫成为如此富有盛名的实验材料？1.秀丽隐杆线虫一般特征秀丽隐杆线虫是一种食细菌的线形动物，学名是Caenorhabditis elegans，通常缩写成C.elegans其成体长仅1mm，全身透明，以细菌为食，居住在土壤中，被称为“自由生活线虫”。
1.1分类地位秀丽隐杆线虫属于线虫门（Phylum nematoda）、侧尾腺纲（Secernentea）、小杆线虫目（Rhabditida）小杆线虫科（Rhabditidae）小杆线虫属（Caenorhabditis）。
秀丽隐杆线虫在高校遗传学实验中的应用
Hereditas (Beijing) 2017年8月, 39(8): 763―768 遗传学教学收稿日期: 2017-03-02; 修回日期: 2017-03-27基金项目:国家自然科学基金面上项目(编号：31471311, 31671409)和深圳市科技创新基金基础研究计划项目(编号：JCYJ20150529152146477)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31471311, 31671409), Shenzhen Science, Technology and Innovation Fund(No. JCYJ20150529152146477)]作者简介: 马小英，博士，研究方向：植物学和遗传学。
E-mail: maxy@通讯作者:谢宇聪，博士，副教授，研究方向：细胞生物学和遗传学。
E-mail: tseyc@DOI: 10.16288/j.yczz.17-076 网络出版时间: 2017/4/14 18:18:51URI: /kcms/detail/11.1913.R.20170414.1818.002.html秀丽隐杆线虫在高校遗传学实验中的应用马小英，赵颖岚，贾方兴，宋亚坤，谢宇聪南方科技大学生物系，深圳 518000摘要: 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans )是模式生物中的重要成员之一，因其实验成本低，实验周期短,非常适宜用于高校的遗传学实验教学中。
线虫在实验教学中的使用，一方面可以有效地丰富高校实验教学的内容，另一方面也可以很好地激发学生的学习兴趣。
本文介绍了线虫在遗传学实验教学中的应用实例，如生活周期观察、单因子杂交、单核苷酸多态性研究、RNA 干扰(RNAi)实验等；对实验设置、操作要求、实验相关准备工作等进行了较为细致的描述，为线虫在高校遗传学实验教学中的应用提供了详实案例，可为线虫在高校遗传学实验或其他相关实验课程如细胞生物学实验、模式生物与发育生物学实验中的应用提供参考。
RNA干扰的原理与应用[试题]
![RNA干扰的原理与应用[试题]](https://img.taocdn.com/s3/m/df2cf8697ed5360cba1aa8114431b90d6c8589f7.png)
RNA干扰的原理与应用王晓然（10微生物102200942）摘要：RNA干扰现象最初被称为转录后基因沉默现象，秀丽新小杆线虫是研究该现象很好的模型；利用该模型探讨了由双链RNA介导RNA干扰的基本原理；并且介绍了利用RNA干扰引发的基因沉默在药物开发的研究中的应用。
关键字：RNA干扰基因沉默秀丽新小杆线虫1.背景介绍RNA干扰是普遍存在于真菌、植物、果蝇等各类真核生物之中的现象，类似于一种古老的免疫机制。
1990年，Napoli教授在研究矮牵牛花查尔酮基因时发现了基因共抑制现象（cosuppression）[1]。
她在体外构建了控制矮牵牛花花色的基因查尔酮基因片段，连上花椰菜花叶病毒的35S启动子，连入农杆菌的T-DNA质粒，在矮牵牛花中过度表达。
她原先预期，查尔酮的过度表达能加深牵牛花花色的紫色，但是结果却导致了矮牵牛花子代花色的褪色，内源性的查尔酮遭到沉默。
Napoli教授把这一现象称之为内源性基因共抑制现象。
1998年，Andrew J. Hamilton教授研究了番茄ACC氧化酶基因的基因共抑制现象。
他利用放射性标记法和放线菌酮处理法分析转录后ACC氧化酶基因的mRNA和成熟mRNA。
实验结果表明，外源重组基因片段能成功转录，但是mRNA成功转录出后，因为某种原因发生了转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing PTGS）[2]。
因此，Andrew J. Hamilton认为内源性基因共抑制现象属于转录后的基因沉默现象。
1998年，Fire和Mello课题组接手了Guo教授研究的秀丽新小杆线虫发育过程中的一个关键基因par-1[3]的课题。
他们以秀丽新小杆线虫为模型，发现在Guo的课题中，引发线虫par-1基因沉默的是小片段的双链RNA[4]，而不是正义单链RNA或负义单链RNA。
他们之后又研究了秀丽新小杆线虫的unc-22基因，进一步阐述了双链RNA在基因沉默中的作用，并创造性地使用了“RNA干扰”这个名词。
秀丽隐杆线虫研究综述
秀丽隐杆线虫研究综述一、本文概述秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称C. elegans）是一种微小的、透明的、生活在土壤中的线虫，自20世纪60年代以来，它已成为生物学研究的重要模型生物之一。
由于其生命周期短、繁殖迅速、基因组小且相对简单等特点，秀丽隐杆线虫被广泛用于研究细胞生物学、发育生物学、神经生物学、遗传学、基因组学等多个领域。
本文旨在对秀丽隐杆线虫的研究进行全面的综述，从基础生物学特性、基因组学进展、到其在各个领域的应用研究，以期为读者提供一个清晰、全面的秀丽隐杆线虫研究图景。
二、秀丽隐杆线虫的基本生物学特性秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称C. elegans）是一种具有独特生物学特性的小型线虫，其身体长度仅约1毫米，属于线虫动物门、无尾感器纲、小杆目、小杆科。
自1974年被悉尼·布伦纳（Sydney Brenner）选为遗传学研究的模式生物以来，秀丽隐杆线虫已成为生物学和医学领域广泛研究的对象。
生命周期与繁殖：秀丽隐杆线虫的生命周期大约为3天，在适宜的环境下，它们能以极快的速度繁殖。
它们通常以细菌为食，尤其是大肠杆菌（Escherichia coli），并通过摄取这些细菌来获取所需的营养。
成年线虫通过自交或雌雄同体交配繁殖，产生的后代数量巨大，每个成虫一生可以产生多达300个子代。
基因组与遗传学：秀丽隐杆线虫的基因组相对较小，约含有1亿个碱基对，使其成为研究基因功能和基因相互作用的理想模型。
由于其生命周期短、繁殖迅速，科学家能够迅速地进行遗传筛选和基因编辑，以研究特定基因的功能。
神经系统与行为：秀丽隐杆线虫拥有相对简单的神经系统，仅由302个神经元组成。
尽管如此，这些神经元足以控制线虫的各种复杂行为，如觅食、逃避、交配等。
这使得秀丽隐杆线虫成为研究神经生物学和行为学机制的重要工具。
衰老与疾病模型：秀丽隐杆线虫因其短寿命和快速的生理变化而成为研究衰老机制的理想模型。
寄生虫基因功能研究的模式生物-秀丽隐杆线虫
种在 土 壤 中 自由腐生 的线 虫 。１ ７ ９ ４年 ， 国科 学 英
家 Ｓ ｄ ｅ ｒｎ ｅ 开 创 性 地 以 Ｃ ｅｅ ａ ｓ 材 料 用 ｙ ｎ ｙＢ ｅ ｎ ｒ ．ｌｇ ｎ 为 于 揭 示 动 物 细 胞 凋 亡 的 分 子 机 制 ｌ 。 目前 这 种 美 丽 】 ］ 的 小 线 虫 已 经 应 用 于 现 代 发 育 生 物 学 、 传 学 和 基 遗
研究 寄 生 虫 基 因 功 能 ， 是 获 得 成 功 的 事 例 却 不 但 多Ｌ１ 。因此 寻求一 个 简单 有效 的研 究 体 系对 研 究 ９】 ＿ ｏ
寄 生虫 生物学 及其 基 因功 能具 有重 要 的现实 意义 。 Ｓ ｒａＥ等 曾应用 了哺 乳 动 物 转 化 体 系 研 究 并 ｅｒ 鉴 定 了曼 式 血 吸 虫 某 些 基 因 的 潜 在 调 控 区＿ 。 １ 该
ｎ ｒ ａ ｄ ｔ ｌｇ ｎ ， 称 Ｃ ｅｅ’ｒ ， 文 名 秀 丽 隐 ｏｈ ｂ ｉ ｓ ｅ ａ ｓ 简 ｉｅ ．ｌｇ ｔ 中 ａｓ 杆线虫 ， 称为 华美 广杆 线 虫 、 丽新 小 杆 线 虫 ， 又 秀 是
一
寄 生虫 启动 子在 哺乳 动 物细 胞体 系 中得 以表 达 的现 象 表 明 ， 这些 不 同 门 的生 物 间基 因转 录 调 控 基元 在 是 充分 保守 的 。因此 ， 用更 为相 近 和 相 关 的物 种 使 研 究蠕 虫基 因表达 系统 将是 一个 很有 说 服力 的转 化
生 虫 基 因 功 能 的 模 式 生 物 方 面 进 行 了 积 极 的 探
讨 ｌ ］ 此外 ， ．ｅｅ ａ ｓ 其 他 领 域 方 面 的 应 用 为 ４ ， Ｃ ｌｇ ｎ 在 防治寄生 虫病 提供 重要 的参 考 依据 。
rna干扰的作用机制及小干扰rna的合成方法
RNA干扰的作用机制及小干扰RNA的合成方法RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。
当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默[1]。
与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi 具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)[2,3]。
在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。
RNAi现象在生物中普遍存在。
1.RNAi的作用机制目前关于基因沉默的假说认为，转录后水平的基因沉默，主要包括起始阶段、效应阶段和倍增阶段。
1.1起始阶段外源性导入或由转基因、转座子、病毒感染等多种方式引入双链核糖核酸(dsRNA)，在细胞内特异性与RNA酶Ⅲ(RNAaseⅢ核酸内切酶) Dicer结合，dsRNA被切割成21~23nt 长度的带有3′端单链尾巴及磷酸化的5′端的短链dsRNA，即小干扰RNA(siRNA)。
1.2效应阶段双链siRNA可以与含Argonauto（Ago）蛋白的核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）并被激活。
在A TP供能情况下，激活的RISC 将siRNA的双链分开，RISC中核心组分核酸内切酶Ago负责催化siRNA其中一条链去寻找互补的mRNA链，然后对其进行切割。
反义链先与同源mRNA配对结合，然后RISC在距离siRNA 3'端12个碱基的位置将mRNA切断降解，从而阻止靶基因表达，使基因沉默[1]。
1.3 倍增阶段siRNA在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA为模板，siRNA为引物，扩增产生足够数量的dsRNA作为底物提供给Dicer酶，产生更多的siRNA，可再次形成RISC，并继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。
神奇的模式生物—秀丽隐杆线虫
神奇的模式生物—秀丽隐杆线虫摘要：本文对秀丽隐杆线虫的模式生物一般特征入手，介绍了线虫形态学、生物学特征和繁殖、基因组和遗传学等方面的内容。
关键词：秀丽隐杆线虫模式生物基因组最近，秀丽隐杆线虫用于生物实验材料倍受科学家们的关注。
进入21世纪以来，已经有六位科学家利用秀丽隐杆线虫为实验材料揭开了生命科学领域的重大秘密而获得了诺贝尔奖。
1974年英国科学家悉尼·布雷内（Sydney Brenner）第一次把秀丽隐杆线虫作为模式生物，成功地分离出线虫的各种突变体，发现了在器官发育过程中的基因规则而获得了2002年诺贝尔生理学或医学奖。
与悉尼·布雷内共同分享诺贝尔奖的有两名科学家，其中一位科学家是英国约翰·苏尔斯顿（John E. Sulston），通过显微镜活体观察线虫的胚胎发育和细胞迁移途径，于1983年完成线虫从受精卵到成体的细胞谱系。
另一位科学家是美国的罗伯特·霍维茨（H. Robert Horvitz），是利用秀丽隐杆线虫作为研究对象进行了“细胞程序性死亡”研究。
克雷格·梅洛（Craig C. Mello）和安德鲁·菲尔和（Andrew Z. Fire）利用秀丽隐杆线虫实验发现一种全新的基因调控方式—RNA干扰（RNAi）而获得2006年诺贝尔生理学或医学奖。
此外，Martin Chalfie证明了GFP(绿色荧光蛋白)作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。
在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色，由此获得了2008年化学奖。
究竟什么原因使秀丽隐杆线虫成为如此富有盛名的实验材料？1.秀丽隐杆线虫一般特征秀丽隐杆线虫是一种食细菌的线形动物，学名是Caenorhabditis elegans，通常缩写成C.elegans其成体长仅1mm，全身透明，以细菌为食，居住在土壤中，被称为“自由生活线虫”。
1.1分类地位秀丽隐杆线虫属于线虫门（Phylum nematoda）、侧尾腺纲（Secernentea）、小杆线虫目（Rhabditida）小杆线虫科（Rhabditidae）小杆线虫属（Caenorhabditis）。
RNA干扰综述
RNAi研究及其进展公光业M110107259前言RNAi是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA 启动的序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。
1998年，Andrew Fire等首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中。
由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力。
RNAi被《Science》杂志评为2010年十大科学成就之一，2002年又名列《Science》杂志十大科学成就之首，成为分子生物学研究的热点。
本文综述了该研究的最新进展。
正文RNAi的发现：上世纪90年代，科学家们在进行生物遗传改良的研究中，发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。
最早报道的是在1990年美国科学家Jorgensen等,他们在增强矮牵牛花紫色的转基因研究中，得到的结果是转基因植株部分或完全开白花，表明色素合成途径被关闭而不是被加强。
他们将这一现象称为共抑制(cosuppresion)，后来的研究者称之为转录后基因沉默。
此后不久，科学家们开展了真菌中的RNAi 的研究。
1994年，意大利的Cogoni在野生型粗糙链抱霉(Neurospora crassa)的转基因研究中，把抑自身和相应内源基因表达的基因沉默现象称为消除作用(quelling或基因压制)。
1995年，Guo等利用反义RNA技术阻断线虫的par-1基因表达，发现无论是给线虫注射正义RN A还是反义RN A，都可以抑制特异基因（par-1）的表达，结果与反义RNA技术的传统机制正好相反。
这种出乎意料的发现引起了各国科学家的注意，从此展开了RNAi在动物体内的研究。
1998年，Frei在研究秀丽隐杆线虫基因沉默时，首次揭开了Guo遇到的悬疑：Guo遇到的正义RNA抑制基因表达现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起的，并且还发现双链RNA能够比反义RN A或正义RNA更有效地关闭基因的表达，抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级，他们称这种现象为RNAi。
RNA干扰及其应用资料
R N A干扰及其应用RNAi是Napoli C D等[1]在试图向紫色矮牵牛花转导色素合成基因,用以增加其花色时发现的。
结果出乎预料,转基因的植株不仅没有新基因的表达,反而自身的色素合成也减弱了,一些转基因的花出现了全白色或部分白色。
他们把这种导入的基因未表达和植物本身合成色素基因的失活现象命名为共抑制(cosuppression)。
之后,Ramano等在向粗糙孢菌(Neurospora crassa)中导入合成胡萝卜素的基因时造成失活,他们称为基因静止(quelling)。
Guo S等[2]发现正义RNA与反义RNA有相同水平的抑制效应，但未能就此现象给出合理的解释。
Fire A等[3]在研究反义核苷酸时发现在线虫体内,双链RNA( double stranded RNA,dsRNA)能有效地抑制有互补序列的内源性基因,且抑制效果优于单链反义RNA。
至此，正式提出了双链RNA诱导的RNAi的概念，开启了RNAi 研究的序幕。
1 RNAi可能的作用机制及特点1.1 RNAi的作用机制虽然RNAi作用的确切机制尚不清楚，但目前普遍认可是Bass假说。
具体概括为三个阶段。
（1）起始阶段。
在细胞内,双链RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ) Dicer 在ATP的参与下被处理为21个～23个碱基的小RNA，即小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。
siRNA是由19个～21个碱基配对形成的双链,并在其3′末端有两个游离未配对的核苷酸。
研究发现, siRNA 是RNAi 作用发生的重要中间分子，序列与所作用的靶mRNA 的序列具有高度同源性；双链的两端各有2个～3个突出的非配对的3′碱基；两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基。
这些是细胞赖以区分真正的siRNA和其他双链RNA的结构基础。
研究表明,平末端的siRNA 或失去了5′磷酸基团的siRNA 不具有RNAi 的功能[4]（2）引发阶段。
四川省绵阳市绵阳中学2024-2025学年高三上学期高考适应性月考卷 (一) 生物学试题(含答案)
四川省绵阳中学2025届高考适应性月考卷（一）生物学注意事项：1．答题前，考生务必用黑色碳素笔将自己的姓名、准考证号、考场号、座位号在答题卡上填写清楚。
2．每小题选出答案后，用2B 铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑。
如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案标号。
在试题卷上作答无效。
3．考试结束后，请将本试卷和答题卡一并交回。
满分100分，考试用时75分钟。
一、选择题：本题共15小题，每题3分，共45分。
在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。
1. 淀粉肠是一种常见的夜市小吃。
依据国家标准，和普通火腿肠对比，淀粉肠中淀粉和脂肪含量更高，蛋白质含量更低。
下列相关叙述正确的是（ ）A. 淀粉肠中有机化合物的共有元素为C 、H 、O 、NB. 淀粉肠的制作原料多为鸡肉，富含不饱和脂肪酸C. 油炸淀粉肠时，会破坏蛋白质中的肽键D. 与普通火腿肠相比，淀粉肠食用后更容易引起血糖上升2. 下列有关同位素标记技术的实验描述，正确的是（ ）A. 人和小鼠细胞膜蛋白融合实验使用同位素标记技术证明细胞膜具有流动性B. 赫尔希和蔡斯使用32P 、35S 同时标记T2噬菌体，证明DNA 是噬菌体的遗传物质C. 用3H 标记亮氨酸的R 基，可以追踪分泌蛋白的合成、加工、运输路径D. 鲁宾和卡门使用18O 分别标记H 2O 和CO 2，通过检测放射性研究光合作用中氧气的来源3. 黑藻是沉水草本植物，其叶肉细胞中含有丰富的叶绿体和中央大液泡，是一种易获得的理想实验材料。
下列相关叙述错误的是（ ）A. 用显微镜观察黑藻细胞质的流动时，视野内细胞中叶绿体的流动方向不一定相同B. 用黑藻做质壁分离和复原实验时，可以同时观察到液泡体积和颜色的变化C. 用黑藻提取和分离光合色素时，加入碳酸钙有利于滤纸条上出现4条色素带D. 用黑藻测定叶绿体产生O 2的最大速率时，需要先测出黑暗条件下的呼吸速率4. 古核生物是一类特殊的生物，在细胞结构和新陈代谢方面与细菌相似，而转录的过程则更接近真核生物。
dsRNA和RNA干扰技术
dsRNA和RNA干扰技术综述 *** 审校彭**(中南大学湘雅医学院)摘要：dsRNA在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象称为RNA干扰。
其机理的日渐阐明使它有可能在基因敲除，基因功能测定等方面成为一项成熟的技术，这将在生命科学领域中引起深刻变化。
本文就dsRNA和RNA干扰的关系，RNA干扰的机制和特点, RNA 干扰技术的应用前景等作一综述。
关键词：dsRNA; RNA干扰 ; RNA干扰技术; 基因沉寂外源和内源性双链RNA（double-stranded RNA dsRNA）在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象称为RNA干扰。
早在十年前，科学家们在向牵牛花转导色素合成基因时，观察到“共抑制”（cosupression）,不仅是转入的基因为表达，而且自身的色素合成也减弱了。
相似的现象还发生在真菌的研究中，当把合成类胡萝卜素的基因转入到红色面包霉中时，却导致了大约30％转染细胞自身基因的失活，这种现象称为“缓解”（quelling）。
但是这种现象一直得不到令人信服的解释。
1998年，在研究秀丽隐杆线虫基因沉默机制时发现，将反义RNA、正义RNA和双链RNA分别导入虫体内，作为对照组的正义核酸，虽不能与活性基因或mRNA结合，却同反义核酸有相似的阻断基因表达能力，与反义RNA传统机制相违背、而另人惊奇的是，双链RNA较正义RNA和反义RNA能更高效地阻断相应基因的表达，一直基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级。
Fire等称这种现象为RNA干扰现象。
RNA干扰现象已证实在一系列的生物中存在，包括植物[1]、真菌[2]、锥虫[3]、囊虫[4]、果蝇[5]和线虫 [6]。
新近科学家在哺乳动物细胞中也观察到了这一现象[7]。
生物界普遍存在的RNA干扰现象给现代生命科学所带来的冲击将是无法估量的，它将不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。
解读诺贝尔医学奖成果RNA干扰机制和医学应用
学科前沿年轻的获奖者２００６年１０月２日，现年４７岁的ＡｎｄｒｅｗＺ．Ｆｉｒｅ和４５岁的ＣｒａｉｇＣ．Ｍｅｌｌｏ由于在ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而今年诺贝尔医学奖获得者，且获奖日期距其研究发表仅８年时间，获奖速度之快亦令人叹为观止。
颁奖委员会评价：“他们发现了控制基因信息流通的基本机制，解释了困惑这一研究者们许久的难题。
”ＲＮＡｉ的殊荣２００１年，随着人类基因组测序的完成，针对其它多种生物的基因组测序计划也相继开展起来。
在未来的一段时间内，科学界将不会出现比人类基因组测序更瞩目的技术。
有人将人类基因组测序称为“２１世纪科学发展史上的里程碑”、“生物学领域最重要的成就之一”。
然而时隔不久，同一年在哺乳动物中发现的ＲＮＡｉ掀起了一场风暴，而且愈演愈烈。
《Ｓｃｉｅｎｃｅ》杂志将ＲＮＡｉ称为“２００２年的重大突破”（Ｃｏｕｚｉｎ，２００２）。
然而，更加令人吃惊和兴奋的是，４年以后的今天，这项技术的始作俑者，ＡｎｄｒｅｗＦｉｒｅ和ＣｒａｉｇＭｅｌｌｏ就因此获得２００６年诺贝尔医学奖。
一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的青睐和肯定，此前是绝无仅有的，这也足见ＲＮＡｉ在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。
ＲＮＡｉ的身世科学家们最早在植物（Ｎａｐｏｌｉ等，１９９０）和脉孢菌（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）（Ｃｏｇｏｎｉ和Ｍａｃｉｎｏ，１９９７）中发现了ｄｓＲＮＡ诱导的ＲＮＡ沉默现象。
ＲＮＡｉ在这些机体中作为抗病毒的防御体系而发挥作用。
虽然在上述发现中，转基因病毒可以编码具有沉默功能的基因片断，并在复制过程中产生ｄｓＲＮＡ，但针对ＲＮＡ沉默现象的决定性发现还是由ＡｎｄｒｅｗＦｉｒｅ和ＣｒａｉｇＭｅｌｌｏ首先完成的。
早在几年前，在线虫中进行反义ＲＮＡ实验时，Ｇｕｏ和Ｋｅｍｐｈｕｅｓ就观察到正义ＲＮＡ也具有很高的基因沉默活性（Ｇｕｏ和Ｋｅｍ－ｐｈｕｅｓ，１９９５）。
秀丽隐杆线虫研究情况
秀丽隐杆线虫研究情况
秀丽隐杆线虫被应用于实验研究至今已逾30年，因为易于实验室培养、基因易处理、解剖学结构简单以及可以提供广泛的遗传学和基因组信息，已成为一种重要的研究细菌和真菌的哺乳动物替代模型。
与黑腹果蝇一样，秀丽隐杆线虫将天然免疫作为防御微生物感染的唯一防线。
Mylonakis等研究发现，一些对哺乳动物起作用的新生隐球菌毒力因子在杀死秀丽隐杆线虫的过程中同样有效，这些基因包括信号转导途径GPA1、PKA1、PKR1、 RAS1和漆酶等；而那些对哺乳动物毒力较低的因子在秀丽隐杆线虫模型中致病性亦较弱。
还有作者通过秀丽隐杆线虫模型研究荚膜、黑色素、调节通路等毒力因子来鉴定毒力减低的新生隐球菌，结果发现rom2基因突变的隐球菌在37℃时失去繁殖及生长的能力，并无法生成细胞壁和难耐高渗。
多数秀丽隐杆线虫是可以自身繁殖的雌雄同体动物，偶尔也可见到雄性单体。
实验结果证实野生雄性线虫较雌雄同体线虫对真菌的抵抗力增强，而且这种抵抗力的增强归因于应激反应激活因子DAF-16的参与，而不是由于行为或生殖方式的不同。
关于秀丽隐杆线虫的综述
关于秀丽隐杆线⾍的综述关于秀丽隐杆线⾍的综述⽣物153班刘通宇摘要：本⽂为关于秀丽隐杆线⾍的综述⽂章，主要介绍了秀丽隐杆线⾍的⼀些基本信息，并结合这些基本信息引出秀丽隐杆线⾍的细胞周期、神经系统等⽅⾯的研究价值与药物筛选、毒性评价⽅⾯的应⽤价值，并结合以上信息讨论笔者对于秀丽隐杆线⾍研究现状的评价以及在药理、进化论等⽅⾯的应⽤与研究展望，并探讨了其在回答⽣命意义中的价值。
关键词：秀丽隐杆线⾍；研究价值；应⽤价值Abstract: This is a summative article about Caenorhabditis elegans, mainly introduced some of the essential information and then elicit the research value on the cell circle, nervous system, and also applications value on medicine screening, toxicity assessment. At the end, the author gives out his personal assessment about the research that had been conducted, and also introduced his personal prospect about the application and research in pharmacology and evolutionism, etc. It also discussed the Caenorhabditis elegans’ role in answer ing the question for the meaning of life.Key words:Caenorhabditis elegans; research value; application value模式⽣物是⽣物学家实验中⽤于探究某种普遍⽣命现象的⽣物物种。
秀丽隐杆线虫中的RNA干扰
材料和试剂1.蠕虫RNAi 克隆/库( Open Biosystems 或者Source BioScience LifeSciences)2.氨苄西林(IBI Scientific)3. IPTG (Gold Biotechnology Inc.)4.LB 琼脂培养基: 琼脂(BD Biosciences), 胰蛋白胨(BD Biosciences), 酵母提取物(BD Biosciences), NaCl (Research Organics Inc.)5. NGM琼脂步骤1. 在含有ampicillin (50 ug/ml) 的LB培养基上（选择性加四环素(12.5 ug/ml)）划线可以表达双链RNA的E coli.并培养过夜。
*注意:这里有两种RNA库. 一个是被Vidal和Heuvel 研究组构建并且可以从Open Biosystems公司订购; 另一个是被Julie Ahringer's 研究组构建可以从SourceBioScience LifeSciences公司订购。
2.将细菌转接到只含有ampicilin (100 ug/ml) 的3 ml LB液体培养基中37℃培养过夜。
3.将3 ml 培养液离心并且倒出上清直到剩下150 ul (浓缩到20x). 重悬沉淀.4.将50 ul 重悬细胞转移到RNAi plate (NGM/IPTG/Ampicillin)的中心. 使它变干(用铝箔纸包好)在室温下诱导过夜(RNAi-接种板可以在用前在室温下保存2-3天。
)5.在每个板中放10-15个蠕虫卵. 在20 or 25℃条件下孵化2-6 h.吸干净培养液并且在想要的温度下孵化直到得到可以用于将来实验的时期为止。
注意:替代蠕虫卵,用漂白剂同步化蠕虫并且将饥饿的幼虫L1转移到RNAi平板上。
喂食配方1. RNAi 平板(NGM/IPTG/Ampicillin)用相同的配方来制做NGM 琼脂培养基但是用终浓度1mM的IPTG和100 ug/ml的氨苄来替代链霉素, 倒入小的培养皿中(35x10 MM).。
线虫RNA干扰的基因沉默
线虫RNA干扰的基因沉默一、实验背景及目的1、RNA干扰（RNAi）是一种使基因使失活的有效方法，在线虫中，RNA干扰因为简单快速成为研究基因功能的有效手段。
2、秀丽线虫是一种生活在土壤中的线虫，长约1mm，直径70um，由959个细胞组成。
它具有生活周期短、易培养和保存等优点。
秀丽线虫具有雌雄同体和雄性个体两种性别。
雌雄同体的线虫有两条X染色体和5对常染色体。
其基因组大小为80Mb，包含13000个基因。
秀丽线虫在20℃时生活周期为3.5天，25℃时约为3天，15℃时约为6天。
受精卵经过胚胎发生孵化出L1、L2、L3 、L4，最后成为成熟的幼虫。
当食物缺乏或群体密度过大等环境不良的条件时，L2会不进入L3而成为dauer幼虫来抵御不良环境，当环境恢复后dauer幼虫不经过L3直接进入L4。
因此可以利用该特性保存线虫品系。
3、RNAi是一种基因knock down 技术，将体外合成的含有目的基因的dsRNA 通过某种方式引入到线虫体内，导致其体内相应的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。
通过显微注射dsRNA或者把线虫浸入到含有dsRNA的溶液中，或者用能够表达dsRNA的大肠杆菌喂食线虫，可以将dsRNA导入大肠杆菌中。
在大肠杆菌HT115中，含有目的基因发夹结构的质粒，在IPTG的诱导下转录出正义和反义的RNA,两条RNA链通过退火形成dsRNA。
当线虫以此大肠杆菌为食时，他们就摄取了大肠杆菌合成的dsRNA，并触发了线虫体内RNA干扰的发生。
4、本实验将利用表达tag--214dsRNA大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi，以达到鉴定tag--214基因功能以及观察实验效果的目的。
二、实验材料及试剂1、材料：1）秀丽线虫（C.elegans）rrf-3突变体（RNAi敏感型）2）大肠杆菌（E.coli）野生型菌株OP503）带有tag-214发夹结构质粒的HT115菌株。
2、试剂：1）NGM普通固体培养基2）含有Amp+和IPTG的NGM固体培养基（用于RNAi）3）LB培养基4）M9缓冲液三、实验操作由于此次试验培养基配制以及大肠杆菌培养等的前期过程是由两个大组分别进行的，我询问了第二大组的实验相关步骤，但还是会有纰漏，所以有些实验过程和实际的操作会有差错，有些细节也会省略。
浅谈小RNA的研究进展
浅谈小RNA的研究进展小RNA（small RNA）是一类长度在20-30个核苷酸之间的非编码RNA，它们在细胞内调控基因表达、维持基因组稳定性以及参与生物体的发育和疾病等方面发挥着重要作用。
随着高通量测序技术的不断发展，小RNA的研究进展取得了飞速的发展，本文将从小RNA的发现、分类、生物功能以及应用等方面进行综述。
小RNA最早的发现是在1993年，研究人员通过对秀丽隐杆线虫（C.elegans）中基因沉默现象的研究发现，短的双链RNA（dsRNA）可以导致基因特异性的抑制。
这一发现为后续小RNA的研究奠定了基础。
根据小RNA的源头和生物起源，小RNA可分为多种类型，例如小干扰RNA （siRNA）、微小RNA（miRNA）、piwi互作RNA（piRNA）和次级siRNA等。
其中，miRNA是最为广泛研究的一类小RNA。
miRNA通过与靶基因的mRNA结合，诱导RNA酶切割并降解靶基因mRNA，或者通过抑制翻译过程来起到调控基因表达的作用。
miRNA参与细胞周期、分化、凋亡和细胞信号转导途径等重要的生物学过程。
近年来，研究人员发现miRNA与许多疾病的发生发展密切相关，如癌症、心血管疾病、神经系统疾病等，因此对miRNA的研究具有重要的生物学意义和临床应用价值。
除了miRNA之外，其他类型的小RNA在研究中也取得了重要进展。
piRNA主要存在于生殖细胞中，并参与调控生殖细胞发育和抑制转座子元件的激活。
piRNA的异常表达与生殖系统肿瘤的发生相关。
次级siRNA是由siRNA依赖的RNA依赖RNA聚合酶合成的小RNA，主要参与抗病毒免疫系统的调控。
最近，研究人员还发现了一类新的小RNA，被命名为tRNA衍生小RNA（tRNA-derived small RNA，tsRNA），它们与细胞的代谢调控、细胞周期和凋亡等相关。
随着研究的深入，小RNA在多个领域有着广泛的应用。
首先，在疾病诊断和治疗方面，小RNA可以作为生物标记物来进行疾病的早期诊断和预后评估。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
秀丽隐杆线虫中R N A干扰作用的遗传分析(总8页)-本页仅作为预览文档封面，使用时请删除本页-秀丽隐杆线虫中RNA干扰作用的遗传分析姓名摘要：秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。
RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA引起的转录后水平的基因沉默（PTGS）现象，是研究基因功能的一种快速和高通量的方法。
本次实验通过饲喂的方法，观察外源RNA分子对秀丽隐杆线虫发育的影响，从而了解RNA干扰的原理、特性及其应用。
通过此次实验，我们达到了实验目的，取得了良好的实验效果。
关键词：秀丽隐杆线虫、RNA干扰（RNAi）、饲喂法1．引言秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。
在理想的条件下（充足食物，20℃）生命周期大约为4d。
秀丽隐杆线虫成体长1～，体宽约70μm，全身透明，以细菌为食，全身共有959个细胞。
研究用的通常是秀丽隐杆线虫野生型（N2）。
从1965年开始，Sydney Brenner以线虫为材料研究发育和神经生物学，现在已经成为经典模式生物之一。
线虫性别是由常染色体和性染色体组的比例决定，有两种性别形式：雌雄同体和雄虫。
雌雄同体的性染色体为XX，而雄虫性染色体为X0。
雌雄同体的秀丽隐杆线虫既产生卵，又产生精子，可以与雄体交配，也可以自体受精进行繁殖，但雌雄同体之间不能异体受精。
在雌雄同体自交繁殖中以%的频率产生雄体（是减数分裂时性染色体不分开造成的）；而雄体与雌雄同体交配其后代两种性别比例为1:1。
线虫有单基因突变形成的表型，例如：运动不协调（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成这些表型的基因有很多个，分别分布于各条染色体上。
这些易于观察的表型作为遗传标记，给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利。
此外，线虫还有许多组织特异性标记的品系。
秀丽隐杆线虫的生命周期很短，20℃仅需4d。
卵在通过受精囊时受精形成一层坚硬的几丁质的外壳，在母体内就开始分裂。
从母体产出的卵大约处于30个细胞期。
胚胎发生很有规律，从卵中孵化出约有550个细胞的幼虫。
从孵化到成体，线虫经历4个幼虫阶段（L1～L4）和4次蜕皮，在身体大小和细胞数目两方面都有增长。
蜕皮的时间（20℃）分别是孵化后13、、和41h；身体长度分别是350、470、640和890μm。
秀丽隐杆线虫孵化后约50h开始产卵，每个雌雄同体可产200到300卵。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA引起的转录后水平的基因沉默（PTGS）现象，是研究基因功能的一种快速和高通量的方法。
目前，在线虫中发展出3种不同的RNAi实验操作方法：① 注射（injection）dsRNA；②将线虫浸泡（soaking）于一定浓度的dsRNA溶液中；③ 用表达dsRNA的工程菌（）饲养（feeding）线虫。
这3种方法各有优缺点，其中饲养法简单易行，适合高通量的基因功能筛选研究，已有用此方法对线虫全基因组进行筛选的报道。
此次实验培养出RNAi型秀丽隐杆线虫的整体步骤是：提取秀丽隐杆线虫总RNA反转录合成cDNA，cDNA经过RT-PCR产生Gene，Gene经过双酶切产生Gene片段。
另外L4440质粒双酶切形成线性L4440质粒。
Gene片段与线性L4440质粒经过T4 DNA连接酶连接形成L4440质粒-Gene，L4440质粒-Gene转入到HT115（DE3）中进行阳性克隆。
阳性克隆后进行PCR鉴定。
之后将阳性克隆产物进行IPTG诱导形成Gene-dsRNA，将其通过饲喂法导入到秀丽隐杆线虫，能产生对目的基因表达和功能的特异性干扰，从而培养出RNAi型秀丽隐杆线虫。
2．材料和方法材料、试剂和器材实验材料：秀丽隐杆线虫野生型（N2）、大肠杆菌OP50、大肠杆菌HT115（DE3）、6种不同的RNA干扰菌株HT115（含有能表达不同gene dsRNA的质粒，对应的性状编号分别为：bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2、lon）实验试剂：LB液体培养基、NGM固体培养基实验器材：实体显微镜、显微镜、粘虫器（pick）、培养皿、锥形瓶、微量移液器、蓝枪头、黄枪头、白枪头、记号笔、酒精灯、火柴、高压蒸汽灭菌锅、封口膜方法活化大肠杆菌OP50打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。
取一个灭菌后的15mL离心管，用微量移液器向其加入3mL LB液体培养基，再向其中加入300μL大肠杆菌OP50。
将15mL离心管放入37℃恒温摇床中振荡培养过夜（8～12h）。
大肠杆菌OP50涂平板大肠杆菌OP50振荡培养过夜后，打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。
用微量移液器取200μL菌液加入到NGM培养基平板中，轻微转动平板使菌液散开，用封口膜将平板封口。
将接种后的平板置于37℃恒温培养箱中培养6～7小时。
向NGM培养基平板中接种线虫从老师提供的线虫培养板中选取有卵的或者L1、L2期雌雄同体线虫（生长时期保证一致），用粘虫器（pick）挑取这些线虫接种到NGM培养基平板中，用封口膜将平板封口。
记录接种的线虫所处的生长时期和接种时间，根据线虫生长时期与温度的关系与自己的实际时间情况合理确定线虫培养方案，选择在不同温度的恒温培养箱（20℃和25℃）中的培养时间，将线虫培养至第四幼虫期（L4期线虫）。
活化干扰菌株和涂干扰板在步骤进行的期间，要进行活化干扰菌株和涂干扰板。
打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。
取7个灭菌后的15mL离心管，用微量移液器向其中加入3mL LB液体培养基和3μL Amp，再分别加入300μL bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2和lon6种干扰菌株以及阴性对照HT115菌株，用微量移液器吹吸混匀。
将这7个15mL离心管做好标记，放入37℃恒温摇床中振荡培养过夜（12～16h）。
之后取7个NGM培养基平板，在超净工作台中，用微量移液器分别取200～300μL 7种活化好的菌液加入到NGM培养基平板中，轻微转动平板使菌液散开，用封口膜将平板封口，在平板的皿底和皿盖上同时做好标记。
将干扰板置于37℃恒温培养箱中培养6～16小时。
此步骤要求这7个干扰板接种的菌株培养好的时间与步骤中将线虫培养至第四幼虫期（L4期线虫）的时间一致。
向7个干扰板中挑取L4期线虫步骤中7个干扰板接种的菌株培养好后，步骤中的线虫也培养至第四幼虫期（L4期线虫）。
此时用粘虫器（pick）分别向7个干扰板中挑取10条L4期雌雄同体线虫，用封口膜将平板封口。
挑取线虫后将干扰板置于20℃恒温培养箱中培养2d。
挑取4～5条L4期雌雄同体线虫到新的干扰板中2d后挑取4～5条L4期雌雄同体线虫到新的干扰板中，用封口膜将平板封口。
与原干扰板共同置于20℃恒温培养箱中培养5d。
观察两个干扰板中的后代表型，统计突变型出现的频率3．结果此次实验中使用了6种不同的RNA干扰菌株HT115（含有能表达不同gene dsRNA的质粒），对应的性状编号分别为：bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2、lon。
同时还使用了起阴性对照作用的RNA干扰菌株HT115，即转入了RNA干扰质粒空载体L4440的HT115。
（1）接种了RNA干扰菌株HT115的平板起阴性对照的作用，线虫不发生突变。
如图一所示。
图一阴性对照的平板中线虫不发生突变图一中的线虫都是雌雄同体线虫，个体比雄虫稍大，产卵器位于身体的中部，体内可见卵或胚胎。
图二是在10×低倍镜下观察的HT115阴性对照线虫。
图二10×低倍镜下观察的HT115阴性对照线虫（2）接种了bli-2干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是成虫身上表皮起泡（尤其是头部），线虫比野生型稍小。
如图三所示。
图三中可以很明显地观察到突变线虫头部表皮起泡。
（3）接种了dpy-2干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是成虫粗短，身体向左转弯，身体僵硬，幼虫正常。
如图四所示。
图四中可以很明显地观察到突变线虫粗短，身体向左转弯，身体僵硬。
（4）接种了dpy-5干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是成虫非常粗短，幼虫正常。
如图五所示。
图五中“A ”是突变线虫，“B ”是未突变线虫（即野生型线虫）。
二者对比可以很明显地看出突变性状。
图六是在10×低倍镜下观察接种dpy-5干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫。
A 图六10×低倍镜下接种dpy-5干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫 BC图五 接种dpy-5干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫 A B图四 接种dpy-2干扰菌株的干扰板中突变线虫图三 接种bli-2干扰菌株的干扰板中突变线虫图六中“A ”是未突变线虫（即野生型线虫），“B ”和“C ”是突变线虫。
二者对比可以很明显地看出突变性状。
（5）接种了him 干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是在干扰板中雄虫出现率提高。
如图七所示。
图七中“A ”和“B ”是雄虫，“C ”、“D ”和“E ”是雌雄同体线虫。
雄虫比雌雄同体线虫身体细、颜色浅，尾部的交配器呈扇形（三角形）。
不过虽然接种了him 干扰菌株的干扰板中雄虫出现率提高，但是雄虫出现的频率仍然较低。
图八是在10×低倍镜下观察接种him 干扰菌株的干扰板中雄虫和雌雄同体线虫。
图八中“A ”是雄虫，“B ”、“C ”和“D ”是雌雄同体线虫。
图中可以很明显地看出雄虫比雌雄同体线虫身体细、颜色浅，尾部的交配器由于被雌雄同体线虫挡住无法观察到扇形（三角形）。
还可以看到雄虫体内的消化管和储精管。
（6）接种了sma-2干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是线虫比野生型短小。
如图九所示。
图八10×低倍镜下观察接种him 干扰菌株的干扰板中雄虫和雌雄同体线虫AB CDABC D E 图七 接种him 干扰菌株的干扰板中雄虫和雌雄同体线虫BA图九接种sma-2干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫实验中发现，突变线虫比野生型线虫短小的性状并不明显，较难观察。
图九中“A”（突变线虫）和“B”（未突变线虫）两只线虫对比可以较清楚地观察出突变性状。
（7）接种了lon干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是线虫各个发育阶段均较野生型长，头部和尾部变尖。
如图十所示。
AB图十接种lon干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫实验中发现，突变线虫比野生型线虫长的性状并不明显，较难观察。
图十中“A”（突变线虫）和“B”（未突变线虫）两只线虫对比可以较清楚地观察出突变性状。