人副流感病毒3型HN糖蛋白受体结合位点中保守氨基酸突变分析重点
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ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－９２７９．２０１６．０２．００５
【摘要】
目的研究人副流感病毒３型（ｈＰＩＶ３）ＨＮ受体结合位点中保守氨基酸功能。方法
采用定点突变与同源重组相结合方法将ＨＮ受体结合位点中的７个保守氨基酸突变为丙氨酸（Ａ）， 分别为Ｒ１９２Ａ、Ｄ２１６Ａ、Ｅ４０９Ａ、Ｒ４２４Ａ、Ｒ５０２Ａ、Ｙ５３０Ａ和Ｅ５４９Ａ，各突变株在ＢＨＫ一２１细胞内表达并测
２．１构建ｈＰＩＶ３ ＨＮ突变体
同源末端的两个
ＰＣＲ产物共转化感受态ＴＧｌ菌，经ＤＮＡ测序，成功 构建７个突变体。 ２．２各突变株免疫沉淀反应 各突变株泳带宽度
和速率与野毒株大体一致（图１）。
１．３痘苗病毒－Ｔ７瞬时表达系统
每孔４×１０’个
ｍｌ １：
源自文库
ＢＨＫ．２１细胞接种６孔板，２４ ｈ后每孑Ｌ接种１
Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
ａｕｔｈｏｒ：Ｗａｎｇ Ｚｈｉｙｕ，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｉｙｕ．ｗａｎｇ＠ｓｄｕ．ｅｄｕ．ｃａ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
Ｕｓｉｎｇ ｖｉｖｏ
痘苗病毒野毒株、
结果
重组株ｖＴＦ７—３由Ｍｏｓｓ教授（美国国家过敏和传染 病研究所）惠赠。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（十）（ｐＢＳＫ＋），含 有ｈＰＩＶ３－ＨＮ，ｈＰＩＶ３－Ｆ和ＰＧｌＮｌ７Ｂ—Ｇａｌ质粒由Ｉｏｒｉｏ 教授（美国麻省大学医学院）惠赠。
１．２引物应用Ｐｒｉｍｅｒ ５软件设计引物，见表１。
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
万方数据
主堡塞堕塑堕压题垂堂苤查！！！！生！旦箜！！鲞塑！塑
垡！！！！苎！垦翌垦！也！！！！！：垒Ｐ生！垫！！！！！！：！！！型！：！
人副流感病毒３型（ｈｕｍａｎ
ｔｙｐｅ
ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ
光度仪测定吸光度（Ａ）∞１。
ａ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ．Ｒ５０２ ｉｓ
ｋｅｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｈｕｍａｎ
Ｆｕｎｄ
ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３；ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ；Ｈｅｍａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ；Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｐｒｏｇｒａｍｓ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（３０９７０１４２，８１２７１８０６）；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔｅａｍ ｉｎ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｗａｓ ｎｏ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
ｏｎ
ＷＴ ａｎｄ ｅａｃｈ
ｆｏｌｄｅｄ
ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｔｏ
ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ＢＨＫ．２１ ｃｅｌｌｓ．
ｍｕｔａｎｔ ＨＮ
１：１００稀释的ｖＴＦ７—３，各突变体与
ｍｌ １：
附豚鼠和人红细胞，不能吸附鸡红细胞。各突变株吸 附豚鼠红细胞能力不同程度降低（Ｐ＜０．０５），各突变株 吸附人与吸附豚鼠红细胞能力大体一致（表２）。 ２．６各突变株神经氨酸酶活性 程度降低（Ｐ＜０．０５）（表２）。 消除蛋白表达效
ｈＰＩＶ３一Ｆ质粒共转染；第二系列：每孔接种１
ＨＬ，Ｗａｎｇ ＺＹ）；Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｊｉｎａｎ ２５００２ １，Ｃｈｉｎａ（Ｚｈｕ ＦＬ）；Ｋｅｙ Ｊｉｎａｎ ２５００１ ２，Ｃｈｉｎａ（Ｗａｎｇ ＺＹ）
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
１００稀释的ｖＴＦ７．３，３７℃孵育１ ｈ，１仙ｇ质粒转染 ＢＨＫ．２１细胞＂１，ｐＢＳＫ＋为阴性对照，野毒株为阳性
对照。
．：：萋繁黼瓣囊溪
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‘』・一‘：．一一ｊ‘’： ｊ。；。一：ｉ・：：ｊ！：ｉ‘，・ｊ。：ｉ，：．：．ｊ，：‘
１．４各突变株免疫沉淀反应
各突变株与交联在
磁珠ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）的小鼠抗ｈＰＩＶ３ ＨＮ蛋白 单克隆抗体（Ａｂｃａｍ Ｍ０２１２２３２１）混合，１０％ＳＤＳ— ＰＡＧＥ，曝光２ ｈ后扫描，Ｐｅｒｋｉｎ 分析。 １．５各突变株表达强度 一抗为小鼠抗ｈＰＩＶ３
定其免疫沉淀反应、蛋白表达效率、促细胞融合、受体结合和神经氨酸酶活性。结果 各突变株在
ＢＨＫ一２１细胞内折叠加工正常并成功转运到细胞膜，其膜表面蛋白表达率与野毒株相比差别无统计 学意义；各突变株促细胞融合活性不同程度下降，Ｒ５０２Ａ降低最多，为野毒株的１４．２％；各突变株受 体结合活性也不同程度降低，突变株吸附豚鼠红细胞与吸附人红细胞的能力大体一致；各突变株神 经氨酸酶活性变化程度不同，Ｒ５０２Ａ下降最多，为１８．６％；Ｅ５４９Ａ下降最少，为９４．９％。结论ｈＰＩＶ３ ＨＮ蛋白受体结合位点中的保守氨基酸对ＨＮ的促细胞融合活性有重要作用，第５０２位精氨酸（Ｒ）是 关键氨基酸。 【主题词】 副流感病毒３型，人；ＨＮ蛋白质；细胞融合；血细胞吸附；神经氨酸酶
ｓｅｖｅｎ
ｃｈａｎｇｅ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｎｄ
ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ａｌａｎｉｎｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｗｅ ｎａｍｅｄ ｔｈｅｍ
ａｓ
Ｒ１９２Ａ．Ｄ２１６Ａ．
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
Ｅ４０９Ａ，Ｒ４２４Ａ，Ｒ５０２Ａ，Ｙ５３０Ａ
ｏｎ
Ｅ５４９Ａ．Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ（ｗｔ）ａｎｄ
ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
Ｃｈｕ
ｈｅｍａｇｇｌｕｔｌｎｉｎ－ｎｅｕｒａｍｌｎｌｄａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｆｕｌｕ，Ｗｅｎ Ｈｏｎｇｌｉｎｇ，Ｗａｎｇ Ｚｈｉｙｕ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｗ Ｈｅａｌｔｈ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎａｎ ２５００１２，Ｃｈｉｎａ（Ｃｈｕ
ｔｏ
ＦＬ，耽ｎ
Ｔａｂ．１ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｈＰＩＶ３
ＨＮ蛋白受体结合位点内保守氨基酸突变所用引物
ｕｓｅｄ ｉｎ ｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈＰｌＶ３ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｔｏ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
ｂｅｔｗｅｅｎ ＷＴ
ａｎｄ ｅａｃｈ
ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｅｌｌ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｅａｃｈ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ
ｍｕｔａｎｔ
ｓｏｍｅ
ｅｘｔｅｎｔ．ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ Ｒ５０２Ａ
ｔｏ
１４．２％．Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ
ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅａｃｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅｒｅ
ｔｏ ｗａｓ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
ｉｔｓ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ
ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｍｏｓｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｍｏｎｇ ｅａｃｈ ｍｕｔａｎｔ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｒ５０２Ａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ｔｏ
ａ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｏ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ—ｂｉｎｄｉｎｇ
ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３（ｈＰＩＶ３）ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ—ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＨＮ）ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＰＣＲ—ｂａｓｅｄ ｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｈｏｍｏＩｏｇｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｉｎ
１８．６％，ｂｕｔ ｔｈｅ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ
Ｅ５４９Ａ
ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ
ｔｏ
ｔｈａｔ
ｏｆ ＷＴ ｈＰＩＶ３ ＨＮ（９４．９％）．
ａｎ
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈＰＩＶ３ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｌａｙ
率影响，各突变株促细胞融合活性不同程度降低 别（Ｐ＜０．０１），Ｒ５０２Ａ最低，为野毒株的１４．２％，第 ５０２位精氨酸（Ｒ）是关键氨基酸（表２）。
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ流式细胞仪分析蛋白表达率
（ＦＡＣＳ）。
１．６各突变株促细胞融合活性测定 孔接种１
ｍｌ
第一系列：每
２．５
各突变株受体结合活性
野毒株及突变株能吸
ＨＮ Ｅｌｍｅｒ Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐｌｕｓ
２．３各突变株蛋白表达率
各突变株蛋白表达率
与野毒株相比差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）（表２）。 ２．４各突变株促细胞融合活性 消除蛋白表达效
蛋白单克隆抗体（１：２０稀释），二抗为ＦＩＴＣ标记山 羊抗小鼠ＩｇＧ（中杉金桥，ｚＦ一０３１２）（１：５０稀释），
Ｂｅｃｔｏｎ
１．７
３，ｈＰＩＶ３）是引起婴幼儿下呼吸道感染的重要
各突变株受体结合活性测定
每孔加２％的
病原¨。，也是引起老年人和免疫功能缺陷者致死的 病原之一’２１，目前无特效的治疗手段＂。。ｈＰＩＶ３感 染宿主需要血凝素神经氨酸酶（ＨＮ）和融合（Ｆ）蛋 白共同参与。与细胞膜表面的唾液酸受体结合的 ＨＮ蛋白激活Ｆ蛋白介导病毒包膜和宿主细胞膜融 合，病毒借此进入细胞内引起机体感染Ｈ。。但ＨＮ 激发Ｆ蛋白促进膜融合过程不清楚。本研究将ＨＮ 蛋白受体结合位点中的７个保守氨基酸突变为丙氨 酸检测功能，表明ｈＰＩＶ３ ＨＮ蛋白受体结合位点中 的保守氨基酸对激发Ｆ蛋白介导膜融合起重要 作用。
主堡塞堕塑蝤压丛垂堂盘查！旦！！至！旦筮垫鲞箜！塑竺！！！！堕！兰翌曼！也！ｉ翌！：垒Ｐ曼！！！！！：！！！：！！：堕！：！
・１２９・
．论著
人副流感病毒３型ＨＮ糖蛋白受体结合位点 中保守氨基酸突变分析
褚福禄温红玲王志玉 ２５００１２济南，山东大学公共卫生学院病毒学研究室（褚福禄，温红玲，王志玉）；２５００２１济 南，山东大学附属省立医院检验科（褚福禄）；教育部实验畸形学重点实验室（王志玉） 通信作者：王志玉，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｉｙｕ．ｗａｎｇ＠ｓｄｕ．ｅｄｕ．ａｎ
基金项目：国家自然科学基金（３０９７０１４２，８１２７１８０６）；山东大学创新团队资助项目
Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ
ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ・ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ
１材料与方法
豚鼠或人或鸡的红细胞稀释液，４。Ｃ吸附３０ ｍｉｎ，洗 涤后加０．０５ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮＨ。ＣＩ溶液，静置１ ｈ取上 清，５４０ ｎｍ下测定Ａ值。 １．８神经氨酸酶活性测定
每孔加０．５
ｍｌ ０．６２５
ｇ／ｍｌ的唾液乳糖钠盐（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），转移至试管，加
０．５
ｍｌ高碘酸（０．０２５ ｍｏｌ／Ｌ），０．４
ａｌｌ ｍｕｔａｎｔ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ
ｔｈｅ ｃｅｌｌ
ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ＢＨＫ－２１
ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ
ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｃｅｌｌ
ｗｅｒｅ
ｆｕｓｉｏｎ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｕｔａｎｔ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ Ｔｈｅｒｅ ｆｕｓｉｏｎ
ｍｌ
２％的亚砷酸 ｎｍ测定
钠溶液，２ ｍｌ硫代巴比妥酸溶液（０．１ ｍｏｌ／Ｌ）和１ ｍｌ酸性丁醇，３０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５
Ａ值¨Ｊ。
ｍｉｎ，５４９
１．９统计学方法ＳＰＳＳｌ６．０分析。数据以元±ｓ表 示，ｔ检验比较突变株和野毒株结果，Ｐ＜０．０５为差 异有统计学意义。
２
１．１病毒、质粒、工具酶和试剂
１００稀释的痘苗病毒野毒株，ＰＧｌＮＴ７３－Ｇａｌ质粒转 染；两系列各１×１０５个细胞混匀加入９６孔板，２０斗ｌ 上清与１３０
Ｉｘｌ １．５
ｍｇ／ｍｌ氯氛红－Ｂ—Ｄ一半乳糖苷
率影响，除Ｅ５４９Ａ各突变株的神经氨酸酶活性不同
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）反应３０ ｍｉｎ后，５７０ ｎｍ酶联免疫分光
万方数据
表１
【摘要】
目的研究人副流感病毒３型（ｈＰＩＶ３）ＨＮ受体结合位点中保守氨基酸功能。方法
采用定点突变与同源重组相结合方法将ＨＮ受体结合位点中的７个保守氨基酸突变为丙氨酸（Ａ）， 分别为Ｒ１９２Ａ、Ｄ２１６Ａ、Ｅ４０９Ａ、Ｒ４２４Ａ、Ｒ５０２Ａ、Ｙ５３０Ａ和Ｅ５４９Ａ，各突变株在ＢＨＫ一２１细胞内表达并测
２．１构建ｈＰＩＶ３ ＨＮ突变体
同源末端的两个
ＰＣＲ产物共转化感受态ＴＧｌ菌，经ＤＮＡ测序，成功 构建７个突变体。 ２．２各突变株免疫沉淀反应 各突变株泳带宽度
和速率与野毒株大体一致（图１）。
１．３痘苗病毒－Ｔ７瞬时表达系统
每孔４×１０’个
ｍｌ １：
源自文库
ＢＨＫ．２１细胞接种６孔板，２４ ｈ后每孑Ｌ接种１
Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
ａｕｔｈｏｒ：Ｗａｎｇ Ｚｈｉｙｕ，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｉｙｕ．ｗａｎｇ＠ｓｄｕ．ｅｄｕ．ｃａ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
Ｕｓｉｎｇ ｖｉｖｏ
痘苗病毒野毒株、
结果
重组株ｖＴＦ７—３由Ｍｏｓｓ教授（美国国家过敏和传染 病研究所）惠赠。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（十）（ｐＢＳＫ＋），含 有ｈＰＩＶ３－ＨＮ，ｈＰＩＶ３－Ｆ和ＰＧｌＮｌ７Ｂ—Ｇａｌ质粒由Ｉｏｒｉｏ 教授（美国麻省大学医学院）惠赠。
１．２引物应用Ｐｒｉｍｅｒ ５软件设计引物，见表１。
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
万方数据
主堡塞堕塑堕压题垂堂苤查！！！！生！旦箜！！鲞塑！塑
垡！！！！苎！垦翌垦！也！！！！！：垒Ｐ生！垫！！！！！！：！！！型！：！
人副流感病毒３型（ｈｕｍａｎ
ｔｙｐｅ
ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ
光度仪测定吸光度（Ａ）∞１。
ａ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ．Ｒ５０２ ｉｓ
ｋｅｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｈｕｍａｎ
Ｆｕｎｄ
ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３；ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ；Ｈｅｍａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ；Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｐｒｏｇｒａｍｓ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（３０９７０１４２，８１２７１８０６）；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔｅａｍ ｉｎ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｗａｓ ｎｏ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
ｏｎ
ＷＴ ａｎｄ ｅａｃｈ
ｆｏｌｄｅｄ
ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｔｏ
ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ＢＨＫ．２１ ｃｅｌｌｓ．
ｍｕｔａｎｔ ＨＮ
１：１００稀释的ｖＴＦ７—３，各突变体与
ｍｌ １：
附豚鼠和人红细胞，不能吸附鸡红细胞。各突变株吸 附豚鼠红细胞能力不同程度降低（Ｐ＜０．０５），各突变株 吸附人与吸附豚鼠红细胞能力大体一致（表２）。 ２．６各突变株神经氨酸酶活性 程度降低（Ｐ＜０．０５）（表２）。 消除蛋白表达效
ｈＰＩＶ３一Ｆ质粒共转染；第二系列：每孔接种１
ＨＬ，Ｗａｎｇ ＺＹ）；Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｊｉｎａｎ ２５００２ １，Ｃｈｉｎａ（Ｚｈｕ ＦＬ）；Ｋｅｙ Ｊｉｎａｎ ２５００１ ２，Ｃｈｉｎａ（Ｗａｎｇ ＺＹ）
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
１００稀释的ｖＴＦ７．３，３７℃孵育１ ｈ，１仙ｇ质粒转染 ＢＨＫ．２１细胞＂１，ｐＢＳＫ＋为阴性对照，野毒株为阳性
对照。
．：：萋繁黼瓣囊溪
。’ｔ‘ｏ．。‘Ｉ．．．
‘』・一‘：．一一ｊ‘’： ｊ。；。一：ｉ・：：ｊ！：ｉ‘，・ｊ。：ｉ，：．：．ｊ，：‘
１．４各突变株免疫沉淀反应
各突变株与交联在
磁珠ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）的小鼠抗ｈＰＩＶ３ ＨＮ蛋白 单克隆抗体（Ａｂｃａｍ Ｍ０２１２２３２１）混合，１０％ＳＤＳ— ＰＡＧＥ，曝光２ ｈ后扫描，Ｐｅｒｋｉｎ 分析。 １．５各突变株表达强度 一抗为小鼠抗ｈＰＩＶ３
定其免疫沉淀反应、蛋白表达效率、促细胞融合、受体结合和神经氨酸酶活性。结果 各突变株在
ＢＨＫ一２１细胞内折叠加工正常并成功转运到细胞膜，其膜表面蛋白表达率与野毒株相比差别无统计 学意义；各突变株促细胞融合活性不同程度下降，Ｒ５０２Ａ降低最多，为野毒株的１４．２％；各突变株受 体结合活性也不同程度降低，突变株吸附豚鼠红细胞与吸附人红细胞的能力大体一致；各突变株神 经氨酸酶活性变化程度不同，Ｒ５０２Ａ下降最多，为１８．６％；Ｅ５４９Ａ下降最少，为９４．９％。结论ｈＰＩＶ３ ＨＮ蛋白受体结合位点中的保守氨基酸对ＨＮ的促细胞融合活性有重要作用，第５０２位精氨酸（Ｒ）是 关键氨基酸。 【主题词】 副流感病毒３型，人；ＨＮ蛋白质；细胞融合；血细胞吸附；神经氨酸酶
ｓｅｖｅｎ
ｃｈａｎｇｅ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｎｄ
ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ａｌａｎｉｎｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｗｅ ｎａｍｅｄ ｔｈｅｍ
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Ｒ１９２Ａ．Ｄ２１６Ａ．
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Ｅ４０９Ａ，Ｒ４２４Ａ，Ｒ５０２Ａ，Ｙ５３０Ａ
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ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
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ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｗ Ｈｅａｌｔｈ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎａｎ ２５００１２，Ｃｈｉｎａ（Ｃｈｕ
ｔｏ
ＦＬ，耽ｎ
Ｔａｂ．１ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｈＰＩＶ３
ＨＮ蛋白受体结合位点内保守氨基酸突变所用引物
ｕｓｅｄ ｉｎ ｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈＰｌＶ３ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｔｏ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
ｂｅｔｗｅｅｎ ＷＴ
ａｎｄ ｅａｃｈ
ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｅｌｌ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｅａｃｈ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ
ｍｕｔａｎｔ
ｓｏｍｅ
ｅｘｔｅｎｔ．ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ Ｒ５０２Ａ
ｔｏ
１４．２％．Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ
ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅａｃｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅｒｅ
ｔｏ ｗａｓ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
ｉｔｓ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ
ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｍｏｓｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｍｏｎｇ ｅａｃｈ ｍｕｔａｎｔ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｒ５０２Ａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ｔｏ
ａ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｏ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ—ｂｉｎｄｉｎｇ
ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３（ｈＰＩＶ３）ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ—ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＨＮ）ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＰＣＲ—ｂａｓｅｄ ｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｈｏｍｏＩｏｇｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｉｎ
１８．６％，ｂｕｔ ｔｈｅ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ
Ｅ５４９Ａ
ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ
ｔｏ
ｔｈａｔ
ｏｆ ＷＴ ｈＰＩＶ３ ＨＮ（９４．９％）．
ａｎ
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈＰＩＶ３ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｌａｙ
率影响，各突变株促细胞融合活性不同程度降低 别（Ｐ＜０．０１），Ｒ５０２Ａ最低，为野毒株的１４．２％，第 ５０２位精氨酸（Ｒ）是关键氨基酸（表２）。
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ流式细胞仪分析蛋白表达率
（ＦＡＣＳ）。
１．６各突变株促细胞融合活性测定 孔接种１
ｍｌ
第一系列：每
２．５
各突变株受体结合活性
野毒株及突变株能吸
ＨＮ Ｅｌｍｅｒ Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐｌｕｓ
２．３各突变株蛋白表达率
各突变株蛋白表达率
与野毒株相比差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）（表２）。 ２．４各突变株促细胞融合活性 消除蛋白表达效
蛋白单克隆抗体（１：２０稀释），二抗为ＦＩＴＣ标记山 羊抗小鼠ＩｇＧ（中杉金桥，ｚＦ一０３１２）（１：５０稀释），
Ｂｅｃｔｏｎ
１．７
３，ｈＰＩＶ３）是引起婴幼儿下呼吸道感染的重要
各突变株受体结合活性测定
每孔加２％的
病原¨。，也是引起老年人和免疫功能缺陷者致死的 病原之一’２１，目前无特效的治疗手段＂。。ｈＰＩＶ３感 染宿主需要血凝素神经氨酸酶（ＨＮ）和融合（Ｆ）蛋 白共同参与。与细胞膜表面的唾液酸受体结合的 ＨＮ蛋白激活Ｆ蛋白介导病毒包膜和宿主细胞膜融 合，病毒借此进入细胞内引起机体感染Ｈ。。但ＨＮ 激发Ｆ蛋白促进膜融合过程不清楚。本研究将ＨＮ 蛋白受体结合位点中的７个保守氨基酸突变为丙氨 酸检测功能，表明ｈＰＩＶ３ ＨＮ蛋白受体结合位点中 的保守氨基酸对激发Ｆ蛋白介导膜融合起重要 作用。
主堡塞堕塑蝤压丛垂堂盘查！旦！！至！旦筮垫鲞箜！塑竺！！！！堕！兰翌曼！也！ｉ翌！：垒Ｐ曼！！！！！：！！！：！！：堕！：！
・１２９・
．论著
人副流感病毒３型ＨＮ糖蛋白受体结合位点 中保守氨基酸突变分析
褚福禄温红玲王志玉 ２５００１２济南，山东大学公共卫生学院病毒学研究室（褚福禄，温红玲，王志玉）；２５００２１济 南，山东大学附属省立医院检验科（褚福禄）；教育部实验畸形学重点实验室（王志玉） 通信作者：王志玉，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｉｙｕ．ｗａｎｇ＠ｓｄｕ．ｅｄｕ．ａｎ
基金项目：国家自然科学基金（３０９７０１４２，８１２７１８０６）；山东大学创新团队资助项目
Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ
ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ・ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ
１材料与方法
豚鼠或人或鸡的红细胞稀释液，４。Ｃ吸附３０ ｍｉｎ，洗 涤后加０．０５ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮＨ。ＣＩ溶液，静置１ ｈ取上 清，５４０ ｎｍ下测定Ａ值。 １．８神经氨酸酶活性测定
每孔加０．５
ｍｌ ０．６２５
ｇ／ｍｌ的唾液乳糖钠盐（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），转移至试管，加
０．５
ｍｌ高碘酸（０．０２５ ｍｏｌ／Ｌ），０．４
ａｌｌ ｍｕｔａｎｔ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ
ｔｈｅ ｃｅｌｌ
ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ＢＨＫ－２１
ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ
ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｃｅｌｌ
ｗｅｒｅ
ｆｕｓｉｏｎ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｕｔａｎｔ ＨＮ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ Ｔｈｅｒｅ ｆｕｓｉｏｎ
ｍｌ
２％的亚砷酸 ｎｍ测定
钠溶液，２ ｍｌ硫代巴比妥酸溶液（０．１ ｍｏｌ／Ｌ）和１ ｍｌ酸性丁醇，３０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５
Ａ值¨Ｊ。
ｍｉｎ，５４９
１．９统计学方法ＳＰＳＳｌ６．０分析。数据以元±ｓ表 示，ｔ检验比较突变株和野毒株结果，Ｐ＜０．０５为差 异有统计学意义。
２
１．１病毒、质粒、工具酶和试剂
１００稀释的痘苗病毒野毒株，ＰＧｌＮＴ７３－Ｇａｌ质粒转 染；两系列各１×１０５个细胞混匀加入９６孔板，２０斗ｌ 上清与１３０
Ｉｘｌ １．５
ｍｇ／ｍｌ氯氛红－Ｂ—Ｄ一半乳糖苷
率影响，除Ｅ５４９Ａ各突变株的神经氨酸酶活性不同
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）反应３０ ｍｉｎ后，５７０ ｎｍ酶联免疫分光
万方数据
表１