第七讲核酶

共价催化
在某些蛋白质酶催化的反应中，反应是通过酶支链上
的活性功能团与反应底物瞬时形成共价键形式的活泼
中间过渡态（如希夫碱）而进行的。
共价中间过渡态的形成可以使一个本来需要很高活化
能的反应分解成两步或多步各需较小活化能的反应。
共价催化可以分为三类： • 第一类，亲核基与最终的受体的反应性相似； • 第二类，亲核基较最终的受体活泼的多； • 第三类，底物与亲核基形成共价加成物会增加底物的
子核酶的催化反应，是核酶催化核心的组分之一
值得注意的是，并不是所有稳定的三级结构都具
有催化活性，研究发现镁离子和其他一些阳离子 也可以稳定I型内含子核酶RNA的错误构象，从而 影响其催化活性.
结构与功能的关系
• 含有10个结构相似的双螺旋区域 • 引导序列：IVS中的6个嘌呤核苷酸序列 • •
• 并于1985年证明其内含子L-19IVS
（intervening sequence lacking 19 nucleotides)在体外能高度特异地催化寡聚
核糖核苷酸底物的切割和连接，具有RNA酶与
RNA聚合酶活性。
1984年Altman等发现RNaseP(核糖核酸酶P)的核 酸组分MIRNA具有该酶催化tRNA前体成熟的活性， 而该酶的蛋白质部分并无酶活性。 1992年Piccirilli等发现L19RNA还具有氨酰酯 酶与RNA限制性内切酶作用。
3. 核酶作用的特点
化学本质：RNA或DNA小分子
结构特点：结构简单，有一个保守的活性中心以及与底
物RNA互补的侧翼序列。
反应特异性:主要通过互补碱基间的亲和力识别特异性
结合底物，因此其作用的底物范围比蛋白酶窄，但目前 已发现有多种催化活性。
催化效率 ：核酶催化效率比蛋白酶低
4.核酶的分类
核酶的发现被认为是近十多年生化领域内最令人鼓舞的发
现之一。为此Cech和Altman共同获得了1989年度诺贝尔化 学奖。
The Mi RNA in ribonuclease P is catalytic The intron in the pre-rRNA of Tetrahemena is self-spliced
GUAA
3’
5’
5‘GAA A UCUoH3’ 3’
GUAA
3’
5’
UCUUAA rRNA
5’GAAA
GOH 3’ G-IVS(414nt)
19nt
L-19IVS (intervening sequence lacking 9 nucleotides)
L-19IVS在体外的多种酶活性
1.转核苷酸作用 2CpCpCpCpC 2.水解作用 CpCpCpCpC 3.转磷酸作用 CpCpCpCpCpCp+UpCpU 4.去磷酸作用 CpCpCpCpCp 5.限制性内切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU + GpN CpCpCpCpC +Pi CpCpCpCpCpC + UpCpUp CpCpCpC + pC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC
(二）核酶与蛋白质酶的比较
1. 核酶与蛋白质酶在结构上的比较 蛋白质是由20多种不同的氨基酸组成的多肽 聚合物，而核酶是由4种核苷酸组成的聚合 物，因此蛋白质的一级结构要比核酶复杂的 多。
蛋白质结构中不同类型氨基酸的支链之间可以 发生复杂的相互作用，而蛋白质主链本身不是 很灵活，具有一定的刚性。因此，很少的几个
反应活性，从而加速反应的进行。
但至目前为至，还末发现采用第二和第三类共价催化
方式的核酶。
酶催化反应中的辅助因子
• 蛋白质酶催化反应的另一个特点是用辅助因子调节和控
制反应的进行。
• 目前还末发现天然核酶利用辅助因子调节和控制反应，
但已发现有些人工筛选的核酶利用辅助因子，如ATP等 调控反应。
• 至今为止的研究结果表明：蛋白质酶比核酶能更有效地
核酶是一种金属依赖酶
金属离子的作用： 1.特异的结构作用，或参与活性部位的化学过程 2.促进RNA的总体折叠 3.二价金属离子（如Mg
2+
）与底物活性部位直接
相互作用，参与过渡中间复合物的形成
镁离子在I型内含子的结构与催化中的作用
•RNA的某些特性很不利于它成为有效的催化 剂．其中一个很重要的因素就是RNA所带的大量负 电荷会阻挠核酸主链之间的靠近和活性构象的形 成． •研究表明二价金属离子即可以促使I型内含子核 酶折叠成稳定的三级结构
第七讲
核 酶 （Ribozyme）
一、概述
以往人们一直认为，只有蛋白质才有催化功能，因 此不言而喻，所有称为酶的生物大分子都是蛋白质。蛋白 质是一类功能分子，而核酸是一类信息分子。蛋白质负责
催化生物体内的生化过程，核酸则负责编码出这些蛋白质。
实际上，在绝大多数现代的生物系统中，情况确是这样。 但到了80年代，人们就开始发现一些例外的情况。
在不同的I型内含子里，保守的配对区之间常会有额外
的配对区，这些配对区按照其上游的保守配对区可以依
次命名为Pm．1，Pm．2等等
对催化活性很重要的P3与P7是两个远程配对区，它们的
两条配对链从核苷酸序列来看相隔很远，Tetrahymena 核酶折叠动力学的研究表明，P3与P7的形成是整个核酶 形成活性构象的限速步骤。
2. 核酶和蛋白质酶在反应机制上的比较
普通酸碱催化与金属离子催化 •蛋白质酶与核酶都可以催化磷酸酯键的水解反 应。 •蛋白质酶催化的磷酸基水解反应的机制同普通 酸碱催化，其活性中心通常是蛋白质本身的某些 氨基酸（如His pKa接近生理pH，可成为亲核反
应的催化中心）。
• 核酶也采用普通酸碱催化的反应机制催化磷酸 酯键的水解，但其活性中心却是二价的金属离 子。（因核苷酸的pKa通常离生理pH较远，无 法成为亲核反应的催化中心）。
锤头核酶 发夹核酶 剪切型核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP Ⅰ类内含子 剪接型核酶 II类内含子
根据催化反应
பைடு நூலகம்
二、剪接型核酶
剪接型核酶的作用机制是通过既剪有接的方
式除去内含子（Intron).
剪接型核酶分类
1、I类内含子
2、II类内含子
1.I类内含子的自我剪接(Self-splicing)
核
一、概述
酶（Ribozyme)
二、剪接型核酶 三、剪切型核酶 四、核酶的应用 五、核酶技术面临的问题 六、脱氧核酶（deoxyribozyme)
（一）核酶（ribozyme)的研究背景
1982年Cech等在研究原生动物四膜虫 （tetrabymena thermophila)细胞rRNA的 基因转录时发现： • 四膜虫26SrRNA前体具有自我剪接(selfsplicing)功能。
内部引导序列
(internal guiding sequence，IGS）
剪 接 部 位
保守序列 G结合位点
剪接部位
I型内含子三级结构
四膜虫I型内含子二级结构折叠成的紧密RNA三级结构，分 为3个结构域： •即P1～P2结构域(含P1、P2)， •P4～P6结构域(含P4、P5、P6)， •P3～P9结构域(含P3、P7、P8、P9)， •保守配对区中间的非保守配对区也包括在相应的结构域内 •在这3个结构域中，P4～P6与P3～P9构成了核酶的催化核 心．
剪接机制 L-19IVS在体外的多种酶活性 核酶是一种金属依赖酶 结构与功能的关系
Ⅰ类内含子的剪接机制
I型内含子核酶所催化的典型反应是包括两步磷酸酯键转移反应的
RNA剪接反应．在这个反应中需要镁离子、外源鸟苷或其磷酸化衍 生物(GMP、GDP、GTP)．
首先，一个外源鸟苷的3羟基攻击5 ’剪接位点的磷原子，并与内
利用辅助因子调控催化反应。
利用内在结合能进行催化反应
• 利用内在结合能进行催化反应是所有生物催化反应的共
同特点。
• 蛋白质酶利用结合能将反应底物准确地固定在反应中心，
核酶也一样，但其效率远低于蛋白质酶。这是因为底物 的固定需要一个刚性的接合部位，而与蛋白质酶相比， RNA的立体结构难以形成一个刚性的结构。
C C C U C U O o
HO-G 3’
C C C U C U O
OA
C C C U C U
OH oA
P +o
+ o
Ao
o
P
O
o G
P-oG o
过渡态
C C C U C U
O
C C C U C U
2+ O Mg
o
P
O
OA
o
Mg 2+
o G
P
O
OA
o G
过渡态
金属离子催化
镁离子等二价金属离子被证明直接参与I型内含
5‘CUCUCU3’ 3’GGGAGG5’
• G结合位点:IVS 中的 P7茎区
I型内含子二级结构
I型内含子的二级结构呈现出很高的保守性．
所有的I型内含子都含有9个特征性的配对区．这些配对
区由5’至3 ’方向被命名为P1～P9； 在两个配对区Pm 和Pn之间的部分被命名为Jm／n． 在一些配对区的顶端是未配对的RNA单链环状区，以与之 相邻的配对区来命名，称为Lm．
内转酯反应
p 5‘
⒈ 外源G的3’-OH 攻击内含子的5’剪 接位点的磷原子， 产生G-内含子和外显 子的3’-OH末端
3’ HO-G
GMP,GDP,GTP
Ⅰ
p
Mg
2+或Mn 2+
P-G OH3，
Ⅰ类内含子催化 自我剪接需要外源 鸟苷和Mg 2+参与， 产物为G-IVS。
p
⒉ 5端外显子的3’-OH攻 击另一个外显子，并与 之相连，同时释放线状 内含子
G-IVS
3’
P-G
p 外显子
3.游离的线状内含子发生 第三次转酯反应而形成环状。
类 内 含 子 的 剪 接 机 制
HO intervening sequence
P-G
IVS 5’
UCUAAA Pre-rRNA
A
GUAA
3’
四 膜 虫 rRNA 前 体 自 我 剪 接 反 应
5’
UCU
pGOH
A A
1990年发现了以DNA为底物的核酶。
1994年发现了脱氧核酶，是一类具有催化活性的DNA小
分子。
1997年Zhang和Cech通过人造RNA分子证明RNA分子具有
肽基转移酶活性。
近年的体外研究表明，第Ⅱ类内含子RNA可以催化加入
核苷酸的RNA编辑过程.
核酶的发现改变了生物体内所有酶都是蛋白质的传统概念 核酶的发现使人们重新审视生物大分子的进化历程
2、Ⅱ类内含子的自我剪接
剪接机制 结构与功能的关系
Ⅱ类内含子的剪接机制
Ⅱ类内含子自我剪接需要Mg
2+参加，但不需
要鸟苷酸参与，而是由内含子中腺苷酸的羟基攻
击5’剪切位点，使5’剪切位点断开，并形成“套
索”状的中间物，然后是3’剪切位点断开，两个
外显子连接，同时释放出“套索”状的内含子， 其反应机制见下图。
结构域Ⅴ：
•高度保守，催化活性必需。
结构域Ⅵ：
•A提供2’-OH 5 ’ 3’
mRNA剪接反
应是在剪接体 （splicesome) 上进行的. 剪接体: 5种snRNA 50多蛋白质
mRNA剪接过程
三、剪切型核酶
1.自身催化剪切型RNA 1.1 剪切机制 1.2 结构与功能的关系 锤头结构 (Hammerhead) 发夹结构(Hairpin) 斧头结构(Axehead) 假结样结构(Pseudoknot-like) 1.3 影响核酶活性的因素
2’
Ⅱ
p 5‘ 套环的形成
HO-A
3 Mg 2+（或一个游离的水分 ‘
子或羟基)
p
3’ OH
p-A p
外显子连接 p
类 内 含 子 的 剪 接 机 制
P-A
HO 3’
Ⅱ类内含子二级结构模式
Ⅱ型内含子有一个保守的 二级结构(6个结构域）： 结构域Ⅰ：
•两个保守内含子结构序列 EBS1,EBS2与两个外显子结构序 列IBS1,IBS2互相配对。
氨基酸就可以形成1个蛋白质酶的三维结构，
而且其活性中心具有很强的刚性。
而由4种核苷酸组成的核酶则不具有蛋白质酶
的这些特性。科学研究表明：核酶需要较大的
结构才能提供较稳定的活性中心，从而有效地
提高反应速度；而小的核酶结构只勉强可以满
足催化反应的需要。最小的天然核酶---锺头
核酶的基本结构也不少于30个核苷酸。
含子5 ’的第一个核苷酸形成3 ，5 磷酸二酯键；
然后，5 外显子的3 羟基攻击3 剪接位点的磷原子，导致内含子
的释放和外显子的连接
剪接反应释放出5 端连有外源G的内含子是I型内含子自剪接反应
的显著特征．在剪接反应完成之后，许多内含子还会催化自身的 环化反应
天然四膜虫内含子核酶所催化的自剪接反应和环化反应均属分子