高等动物基因哺乳动物表达系统优秀课件

（2）高效表达外源基因受体细胞应具备下列条件：
细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大规 模培养 合适的标记 便于转化株的筛选和维持 遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存 生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制 安全性能好 不合成分泌致病物质，不致癌
(3) 常用的高等哺乳动物受体细胞
缺点：哺乳动物细胞的表达水平低； • 获得高表达细胞株所需的时间长； • 细胞大规模培养的成本高； • 哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的成本较高；
哺乳动物细胞表达系统的构成
•受体系统
•转基因技术
•载体系统
（二） 哺乳动物宿主系统
（1）正常的哺乳类动物细胞具有四大生物学特征:
锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能 生长分裂 血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 形态依赖性：细胞扁平状，并有长纤维网状结构
5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）
从头合成途径
氨基喋呤（AP） 氨基喋呤（AP）
尿嘧啶核苷一磷酸（UMP） 氨基喋呤（
GMP 次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP AMP） 胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）
补救合成途径
次黄嘌呤磷酸核糖 转移酶（HPRT）
次黄嘌呤（H）
胸腺嘧啶核苷激 酶（TK）
胸腺嘧啶核苷（TR）
1. 迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模 生产的高等哺乳动物受体细胞主要是中国仓鼠卵巢细胞（CHO） 其优势有如下几个方面： 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS）
高等动物基因哺乳 动物表达系统
第七章 高等动物基因工程
高等动物基因工程的基本概念 哺乳动物表达系统 转基因动物与动物反应器 基因治疗
第一节 高等动物基因工程的基本概念
高等动物基因工程
高等动物转基因技术
哺乳动物细胞表达系统
转基因动物个体
哺乳动物品种改良 疾病模型用于药物筛选研究 基因治疗
动物工程细胞
腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说， 绝大多数的腺病毒成员均能致癌。
1.腺病毒结构
20
腺病毒感染细胞过程
人腺病毒DNA
腺病毒的基因组DNA
IVa2 VA L1 L2 L3 L4 L5
ITR
ITR
E1
E2
E3
E4
腺病毒基因组DNA全长36 kb，其包装上限为原基因组的105%， DNA两端各有 一个反向重复序列（ITR）；E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的 表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子， L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期 基因；IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。E3区缺失只会影响病毒颗粒 的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2 kb的片段， 使得载体的装载量提高到4 kb以上。
(1)哺乳动物细胞表达载体应具备的条件：
① 基本的元件：增强子、终止信号和poly(A)信号、多克隆位点、剪接信 号、筛选标记等；
② 易于扩增至足够数量，能够在哺乳动物细胞内稳定存在、不丢失：哺 乳动物细胞无天然质粒；
③ 能够在哺乳动物细胞内高效表达的强启动子：一般细胞不过量表达蛋 白
（1）病毒类载体
人腺病毒DNA 猴空泡病毒DNA（SV40） 人乳多瘤病毒DNA（BKV） 人牛痘病毒DNA
1. 人腺病毒DNA
腺病毒的生物学特性
腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个 成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒 有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型 （Ad5）病毒。
5. MDCK细胞：1958年从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离获得
的，是贴壁生长的上皮样细胞：有报道用该细胞结合人巨细胞病毒 早早期启动子可高效表达分泌蛋白，表达量占细胞分泌蛋白质总量 的15%～20%。
(4) 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
营养缺陷型的哺乳动物受体细胞
嘌呤核苷酸生物合成途径
嘧啶核苷酸生物合成途径
蛋白多肽物质大规模生产 药物筛选研究评价模型
第二节 哺乳动物表达系统
A 哺乳动物表达系统的优缺点 B 哺乳动物表达系统的受体系统 C 哺乳动物表达系统的载体系统 D 哺乳动物表达系统的基因转移方法 E 提高哺乳动物细胞表达重组蛋白的方法及应用
（一）哺乳动物细胞表达系统优缺点：
优点：表达的蛋白与天然蛋白在结构、糖基化、磷酸化、 寡聚体类型和方式上几乎相同，且能正确组装成多亚基 蛋白。如EPO（促红细胞生成素）
2. 1981年，Gluzman用编码野生型T抗原但复制起点缺失的SV40， 转化允许SV40裂解性生长的非洲绿猴肾细胞CV-1，获得了三 个细胞系：COS1、COS3、COS7。这三个细胞系均含有T抗 原，保留完全的允许SV40裂解性生长的能力（被广泛地用于 瞬时表达系统）。
T抗原作用：当表达产生的T抗原结合到SV40的复制点的DNA 调控区，病毒DNA的复制即被启动。
二氢叶酸还原酶（DHR）
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
营养缺陷型的哺乳动物受体细胞
含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的（tk -）受体细胞 不能在含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基 上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补
含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的 （hprt -）受体细胞 不能在含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基 上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记
遗传标记
编码产物
筛选药物
作用机理
XGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸
思考：COS细胞作宿主细胞表达的优势？
3. BHK-21：1961年从地鼠幼鼠的肾脏分离而来成果：用它表达的重
组凝血因子VIII已获准投放市场。
4. C127细胞：来自RIII小鼠乳腺肿瘤细胞，特别适用于带有牛乳头
瘤病毒（BPV）载体的转染：用C127细胞生产的重组人生长激素 （hGH）已获准投放市场，用于治疗生长激素缺乏症。
TK-
胸腺嘧啶核苷激酶
氨基喋呤
DHFR- 二氢叶酸还原酶
氨甲喋呤
XGPRT合成GMP TK合成TMP DHFR变体抗氨甲喋呤
APH HPHADA-
氨基ห้องสมุดไป่ตู้苷磷酸转移酶 潮霉素B磷酸转移酶 腺嘌呤核苷脱氨酶
G418
APH灭活G418
潮霉素B
HPH灭活潮霉素B
腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活Xyl-A
（三）哺乳动物细胞载体系统