项目二:发酵条件优化及扩大培养

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9. 培养及配制的基本流程 10. 培养基配制的计算
第四章 种子的扩大培养
一. 种子的制备
由保藏的菌种开始,经过逐级扩大培养,最后获 得供生产车间发酵罐接种的足够数量和优质质量 的种子。
适合工业化发酵生产的种子必须满足: 生长活力强,移种后能迅速生长,停滞期短 菌体的生理特性及生产能力稳定 菌体总量及浓度能满足发酵罐接种量的要求 无杂菌污染
3. 种子培养基成分还应考虑与发酵培养基 的主要成分相近。
3. 发酵培养基
作用:供菌种生长、繁殖和合成产物 要求:快速生长;防止过早衰老;迅速合成
产物 特点:
少用速效营养,多用迟效营养,碳氮比适宜 原料价格低廉,质量稳定,取材容易 尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响 有利于提高单位营养物质的最大产率 尽量减少副产物的形成,便于分离纯化
有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感,因 为有些金属离子是中间代谢酶的抑制剂或激活 剂。
因此对于有重大影响的金属离子必须严格控制。 如柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响 产量,钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用, 而钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的,这 些在培养基配制时都必须予以注意。
2. 氮源
构成微生物细胞物质和含氮代谢产物
有机氮源:黄豆饼粉、棉籽粉、玉米浆、 蛋白胨、酵母粉、鱼粉、尿素等
无机氮源:铵盐、硝酸盐、氨水等
3. 无机盐和微量元素

核酸和蛋白质的必要成分;代谢调节; 与钙盐发生沉淀;缓冲剂

含硫氨基酸的组成成分和某些辅酶的活性基
铁 镁、锌、钴、锰 钠、钾、钙 氯
解决办法:先配制1g/L的硫酸亚铁母液100ml (称量0.1g硫酸亚铁,溶于水后定容为100ml) 在配制A培养基时,取10微升该硫酸亚铁母液 培养基中某物质的终浓度×培养基体积=母液浓
度×取用的母液体积
母液的配制
A培养基中硫酸亚铁含量为0.1mg/L,配制 的硫酸亚铁母液浓度为1g/L,相当于浓缩 了10000倍,所以该母液称为10000 ×的母液
正交实验
四. 培养基的设计与选择
1、提供必要的营养成分:培养基成分必须满足细 胞生长,代谢活动和合成产物所需的基本要求。
2、配制合适的浓度:可以从发酵动力学有关生长、 产物合成和基质利用物料平衡的关系中大致推算 或大致计算出所需主要原料的需要量。
3、主成分与其他成分的配比。
C/N比,过高则菌体生长缓慢,过低则衰老自溶
1. 培养基的主要成分包括哪些 2. 以葡萄糖作为碳源有什么优缺点 3. 以淀粉为碳源有什么优点 4. 常见的有机氮源包括哪些 5. 什么叫做前体 6. 培养基的碳氮比过低可能造成什么影响
本章节复习题库
7. 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌四大类微 生物的典型培养基名称
8. 发酵产物是菌体细胞以及发酵产物是菌 体代谢产物时,对培养基的碳氮比要求分 别如何
(3) 注意阻遏物或抑制剂的影响
培养基中存在反馈阻遏物或分解阻遏物 均能影响酶的合成,降低发酵产量。
有些酶的抑制剂却能提高某些代谢产物 的产量,最早利用抑制剂提高中间代谢 物产量的例子是甘油发酵中加入亚硫酸 钠。
在培养基配制时必须注意加入有益的抑 制剂,而避免混入有害的抑制物。
(4) 金属离子的影响
五. 四大类微生物的典型培养基
六. 配制培养基的基本流程
1. 原料称量和溶解
2. 酸碱度的调整
3. 培养基的过滤和澄清 4. 培养基的分装
5. 塞棉塞和包扎
6. 培养基灭菌
7. 培养基的储存
母液的配制
为什么要配制母液?
因为该物质在培养基中含量太低难以称量
例:某A培养基中硫酸亚铁含量为0.1mg/L,要配 制100ml该培养基,则需称量0.01mg硫酸亚铁,天 平很难称量
项目二
发酵条件的优化 及扩大培养
发酵工艺流程
空气 空气净化处理
菌种 斜面活化
碳源、氮源、 无机盐等营养 物质
扩大培养
种子罐
灭菌 主发酵
产物分离纯化
成品
项目二:发酵条件的优化及扩大培养
提出项目任务 分析任务 解决任务 总结及扩展
项目二:发酵条件的优化及扩大培养
提出项目任务 分析任务
摸索最佳培养条件制备种子液
1. 种子的制备流程
种子的制备一般包括在固体培养基上生产 大量孢子的制备过程和在液体培养基中培 养大量菌丝的种子制备过程。
固体孢子进罐 液体菌丝进罐
2. 种子罐种子制备
种子罐级数:种子在种子罐中扩大培养的 次数;
发酵级数:种子罐的级数加一; 种子罐的级数主要取决于菌种的性质、菌
体生长速度及发酵罐的容积
(2)还要注意有些营养物质被利用后培养基的pH 变化情况.
(3)控制pH最常Baidu Nhomakorabea的方法是在培养基中添加具有 一定缓冲能力的物质作为营养物,如以磷酸盐作 为磷的成分;或者避免使用容易产生生理酸性或 碱性使培养基pH波动太大的物质。
5、避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀
葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作 用形成深褐色物质。这种物质不被微生物利用。 因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌, 而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内。
维生素 氨基酸 碱基及其衍生物
7. 水
二. 培养基的类型
按组成成分 合成培养基 天然培养基
按物理状态 固体 半固体 液体
二. 培养基的类型
按特殊用途分 鉴别培养基 分离纯化培养基 基本培养基 加富培养基 生理生化培养基
二. 培养基的类型
按生产用途分
孢子培养基 种子培养基 发酵培养基
注意到,要配制100ml的A培养基,需取10 微升1g/L的硫酸亚铁母液,100ml是10微升 的10000倍
所以,10000 ×的母液即母液浓度为培养基 终浓度的10000倍,取用量为所配制培养基 体积的1/10000
母液的配制
①培养
基的终 浓度
②要配 ③母液 ④配培
制的培 的浓度 养基时
养基体
取用母

液体积
0.1mg/L 100ml 1g/L 10ul
③/ ① ④/2 10000 1/ 10000
培养基中某物质的终浓度×培养基体积= 母液浓度×取用的母液体积
10000×的溶液即配制时浓缩10000倍,取用时按培养基体积的 1/10000取用
母液的配制
例:物质A在培养基中的终浓度为20mg/L, 要配制100×的A母液100ml,应加入几克A
4. 前体
加入到发酵培养基中的能够直接被微生物在 生物合成过程中结合到产物分子中去而自身 结构没有显著变化的一类小分子物质。
提高产品的产量,控制合成代谢产物流向。 少量多次加入,减少前体的毒性。
5. 促进剂和抑制剂
6. 生长因子
微生物生长不可缺少的微量有机物质。 能够提供生长因子的天然物质有:酵母膏、 蛋白胨、麦芽汁、玉米浆、动植物组织或 细胞浸液及微生物生长环境的提取液。
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1. 适合工业化发酵生产的种子必须满足什 么要求
2. 种子进罐有哪几种形式 3. 什么叫种子罐级数 4. 种子罐的级数如何确定 5. 什么叫发酵罐级数 6. 种子的质量标准可以通过哪些方面来判
定 7. 对于5L的发酵液来说,通气量(vvm)为
0.5时,空气流量计应调节为多少L/H
(2) 添加诱导物:
目前工业用微生物酶多数为诱导酶,如蛋白酶、 淀粉酶、纤维素酶等。
诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成。 酶的正常底物或底物的类似物都可作为诱导物。 在各种微生物酶的发酵培养基中必须加入诱导
物,例如淀粉、糊精或麦芽糖是淀粉酶或糖化 酶的诱导物。只有添加这些物质的培养基,才 能获得高产。
硫酸铵中的SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙, 因此二者也不宜直接配成培养基。
6、注意代谢调节物的影响: 有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或
抑制发酵产物的形成。 前体物质 诱导剂 阻遏物 抑制剂 金属离子
(1) 添加有关前体物质:
• 在发酵中添加前体物质将有利于产物的 合成和显著提高产量,如苯乙酸及其衍 生物被认为是青霉素的前体物质。
实验二: 发酵条件的优化 ◆ 正交试验 ◆ 摇瓶培养技术 ◆ 生物量的测定方法 ◆ 产淀粉酶能力测定
项目二:发酵条件的优化及扩大培养
提出项目任务 分析任务 解决任务 总结及扩展
◆ 总结实验出现的问题 ◆ 系统概括项目流程 ◆ 补充相关理论知识(其他 各种生物量测定方法) ◆ 培养基母液的配制 ◆ 正交试验实验设计题 ◆ 分析各培养因素的影响
配500ml该培养基,应加入几毫升100 ×的A 母液?
某培养基中含B,把B配成20×的母液,问, 要配200ml该培养基,应该加入几毫升20×的 B母液?
课堂作业
N=14 O=16 Ca=40 Cl=35.5 Mg=24 S=32 Zn=65 Cu=64 Co=59
K=39
I=127
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三. 正交实验
正交试验是一种高效率、快速、经济的实验设计 方法,用于研究多因素多水平的实验。它是根据正交 性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验, 这些有代表性的点具备了“均匀分散,齐整可比”的 特点。日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择 的水平组合列成表格,称为正交表。例如作一个四因 素三水平的实验,按全面实验要求,须进行34=81种组 合的实验。若按L9(43)正交表安排实验,只需作9次实 验,显然大大减少了工作量。因而正交实验设计在很 多领域的研究中已经得到广泛应用。
4、控制合适的pH:微生物的生长繁殖或产物的合 成往往需要—定的pH环境,在最适pH值下有利于 加快各种酶的反应。因此在整个发酵过程中应使 培养基的pH适合于微生物生长或产物合成所需。
pH的具体控制方法
(1)可以在微生物培养过程中加入酸或碱或流加 某些营养物质调节培养基的pH,但更应在配制培 养基时考虑所用营养物质的组成成分,使其pH值 适合该微生物生长或合成代谢产物的需要。
2.种子培养基 (包括摇瓶种子和种子罐培养基):
培养种子的目的:
1、扩大培养,增加细胞数量; 2、同时也必须培养出强壮、健康、活性
高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或 菌丝快速生长。
种子培养基特点:
1. 必须有较完全和丰富的营养物质,特别 需要充足的氮源和生长因子。
2. 种子培养基中各种营养物质的浓度不必 太高。供孢子发芽生长用的种子培养基, 可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。
1. 孢子培养基
供菌种繁殖孢子 1. 富含有机氮源,少含或不含糖分。有机
氮有利于菌体的生长繁殖,能获得更多的 细胞。 2. 对于放线菌或霉菌的产孢子培养基,则 氮源和碳源均不宜太丰富,否则容易长菌 丝而较少形成孢子。 3. 斜面培养基中宜加少量无机盐类,供给 必要的生长因子和微量元素。
二. 种子质量的控制与分析
(一)影响种子质量的因素及其控制 培养基 培养条件 种龄 接种量
接种量的大小与该菌在发酵罐中生长繁殖 的速度有关
(二)种子质量标准
种子的生长状况 营养物质含量与pH值变化 产物生成量 特殊酶的活力 无污染
(三)种子异常分析
菌种生长发育缓慢或过快 菌丝结团 菌丝黏壁
解决任务 总结及扩展
项目二:发酵条件的优化及扩大培养
提出项目任务 分析任务 解决任务 总结及扩展
第二章 培养基 ◆ 培养基的设计与选择 ◆ 培养基的制备流程 ◆ 孢子/种子/发酵培养基的特点 第四章 种子的扩大培养 ◆ 种子的制备流程 ◆ 种子的质量标准
项目二:发酵条件的优化及扩大培养
提出项目任务 分析任务 解决任务 总结及扩展
第二章 培养基
一. 培养基的成分
培养基的主要成分: 碳源、氮源、无机盐、微量元素、水、 前体和生长因子等。
1. 碳源
既是构成菌体细胞和代谢产物的主要元素, 又是提供微生物生命活动中所需能源的原 料。
常用碳源: 碳水化合物(糖类)、油脂、有机酸和醇、 碳氢化合物等。
葡萄糖 糖蜜 淀粉 油脂 有机酸、醇
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