酵母菌的分离与培养条件的优化

结论
• 1、 经观察菌种生长发现稀释梯度为10-8、 10-9 的菌种进行涂布生长较好 • 2、 有机氮源比无机氮源效果好 • (NH4)2SO4比NH4NO3、 NaNO3效果好 • （NH4）2SO4 2%比（NH4）2SO4 4%效 果好
一、实训要求 1、YPT培养基：酵母菌1%，蛋白胨2%,葡萄 糖2%； 2、灭菌装料量60%； 3、设定参数：PH=5，T=30℃，转速 180r/min; 4、接种与培养（接种量10%） 注：（1）发酵罐是否正常运行、各参数； （2）随时间的延长适当调进气量、搅拌速 度； （3）取样30min/次、镜检2h/次，样品进 行两个平板培养。
四 实验内容
1、分离单菌落
（1）实验wenku.baidu.com品灭菌
仪器：包扎9个移液管、9个涂布器、9个装有9ml 蒸馏水的试管、16个平板、 液体：3g酵母浸粉1%、6g蛋白胨2%、6g葡萄糖 2%，配成300ml溶液，取240ml溶液平均分装两个三 角瓶中，然后每个三角瓶放入2.4g琼脂，剩下60ml 为液体培养基，然后将以上设备拿去灭菌
• 5、接种
• 5.1准备好合格的摇床菌种，接种量根据工艺要求 确定。
• 5.2用75%酒精棉球擦洗进料口四周后，搁上接种 火圈，并在接种火圈内围上酒精棉球，接种者双 手也需用酒精棉球擦洗消毒。 • 5.3减少进气量，控制罐压在0.02MPa左右后，点 燃接种火圈内的酒精棉球。 • 5.4 拧下进料口螺盖，放入盛有酒精的培养皿中。 • 5.5将接种瓶是瓶口在火焰上烧一下，并在火焰的 保护下拔下瓶塞，迅速将菌种倒入发酵罐内。 • 5.6旋上进料口螺盖后灭火焰，拧紧螺盖，并用酒 精棉球将进料口擦洗干净。
2.5空消完毕，关闭进气阀及底阀处的蒸汽阀，打开 底阀开始排污。 2.6开大罐面排气阀，卸去罐压后，打开罐盖上的进 料口加入培养基。
3 、加培养基
3.1 投料前，应校正并安装PH电极和OD电极。 3.2 按工艺要求配置好培养基原液，加入发酵罐内。 3.3 加水定容至60%-65%左右后，启动电机搅拌 5min
• 4.4 调节罐面排气阀，保持罐压0.11mpa，维持
温度121℃ -123℃ 之间，计时实消20min。 • 4.5 实消完毕，关闭底阀后关闭底阀处的蒸汽阀。 • 4.6 在关闭进气阀处的蒸汽阀的同时打开NB型过 滤器的出气阀，进行换气，保持罐压0.05mpa0.08mpa之间。 • 4.7 关闭夹套排污阀后，迅速打开夹套手动进水 阀和夹套排污阀进行降温，当培养基温度降到90 左右时，开搅拌低速控制。
• 二、基本原理
• 酵母菌是单细胞真菌生物，具有很高的营养价值， 特别是含有较多蛋白质、B族维生素、核酸和矿 物质，同时也能产生一些保健功能活性物。因酵 母属于简单的单细胞真核生物，易于培养，且生 长迅速，被广泛用于现代生物学研究中。是遗传 工程研究过程中常用的受体菌种。从自然界或商 品中分离纯的酵母菌株，通常采用平板或斜面涂 布划线法。这两种方法简单有效，是实验室分离 纯化菌种常用到的方法。 • 在发酵过程中定时地取样测定，包括对菌体进行 镜检、测定不同时期发酵液的菌体浓度、残留的 还原糖等参数，动态地了解发酵过程中过程变量 的变化，分析菌体生长、基质消耗、产物生成的 速度，研究发酵动力学，为生产中优化培养条件 提供数据依据。
原液 1.066A 0.939A 1.036A 0.833A 1.092A 1.102A 1.328A
• 残糖量 • 空白 • 费林试剂A5ml+费林试剂B5ml+10ml水+6ml标准 葡萄糖 • 样品 • 费林试剂A5ml+费林试剂B5ml+10ml水+0.5ml样 品 • 测定结果 消耗标准葡萄糖 残糖量 • （NH4）2SO42% 7.08ml 1.744% • （NH4）2SO44% 6.5ml 1.86% • 对比 6.98ml 1.764%
• （三）仪器设备
• 超净工作台，756型分光光度计，旋转式摇床， 恒温培养箱，全自动灭菌锅，三角瓶、涂布器、 移液管、平皿等玻璃仪器。
• （四）试剂 • 酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂 (NH4)2SO4
2%、 (NH4)2SO4 4%、 NH4NO3 2% NH4NO3 4%、 NaNO3 2%、 NaNO3 4%等；裴林试剂甲 液、裴林试剂乙液； NaOH溶液、HCl等。
蛋白胨+5ml种子液
培养
• 时间 9：20 • 条件180r/min 30℃的摇床
测种子液的OD值
• 将种子液稀释10倍，以YPD培养液为标准 液测其OD值 • 测得OD值17.2%T
取样
• 两小时后（11：20）
• PH值均为6 • OD值: •
• • • • • • • (NH4)2SO4 2% (NH4)2SO4 4% NH4NO3 2% NH4NO3 4% NaNO3 2% NaNO3 4% 对照
设计型实验 酵母菌的分离及培养 条件的优化
一、目的要求
1、掌握培养基的配置及灭菌方法，能够正确的配制 培养基并在高压灭菌锅内进行灭菌。 2、熟知培养基成分的选择原则，能够对培养基的成 分和配比进行优化设计。 3、掌握固体斜面、平板的制备技术，能够通过划线、 涂布等方法分离菌种。 4、熟知影响酵母菌生长繁殖各种培养条件，能够对 摇瓶培养条件进行优化设计。 5、了解酵母菌培养过程的代谢变化规律。掌握酵母 菌培养过程参数的测定和分析方法。
2、设备空消
2.1空消前，将控制系统退出自动运行状态，小心取出 PH电极和DO电极，进行清洗、校检、备用，并装好 电极堵头。 2.2打开夹套排污阀，同时打开夹套蒸汽阀进汽，在同 时向罐内排光冷凝水之后，关闭夹套蒸汽阀，直至空 消结束。 2.3缓慢打开进气阀及底阀处的蒸汽阀进汽，待压力升 至0.01Mpa后，打开罐面排气阀进行排气。 2.4调节罐面排气阀，保持罐压0.01Mpa,维持温度在 120℃~125℃之间，计时空消30min
• （2）划线涂布 • 超净台上： • 1、把240ml的培养基分别倒入15个平板，每个 平板为12~13ml，平板分别标10-2~10-10，还 有倒一个斜面 • 2、取1ml的菌原液进行稀释梯度为10-3~10-10 • 3、划线涂布 划线为原液从10-2~10-7；涂布 从10-3~10-10用对应的稀释梯度液，10-2用原 液涂布
二、配制 1、配多少培养基 10L罐装料量60%：10X60%=6L 接种量10%：培养基5400ml(实际操作培养基 5000ml)，种子液600ml 2、配方用多少 6L:60g酵母浸粉1%,120gc120g葡萄糖2%； 150ml:1.5g酵母浸粉1%,3g酵母浸粉1%,3g葡 萄糖2%.其中100ml加1g琼脂配成固体培养基用于 倒平板；50g原液用于测OD时做标准液。 3、所需器材包扎灭菌 4个装有9ml蒸馏水的试管，6个空试管，4个涂 布器，4个移液管1ml，6个平板
• 三、实验材料
• （一）菌种：从安琪酵母中分离的酵母菌 • （二）培养基 • 基础培养基YPD： • 酵母浸粉1% 蛋白胨2% 葡萄糖 2% 固体培养 基再加琼脂2% • 优化N源培养基： • 酵母浸粉1% (NH4)2SO4 2% 葡萄糖 2% ； • 酵母浸粉1% (NH4)2SO4 4% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% NH4NO3 2% 葡萄糖 2% ； • 酵母浸粉1% NH4NO3 4% 葡萄糖 2% ； • 酵母浸粉1% NaNO3 2% 葡萄糖 2% ； • 酵母浸粉1% NaNO3 4% 葡萄糖 2% ；
(3) 1.酵母浸液0.5g NaNO3 1g 葡萄糖1g • 2. 酵母浸液0.5g NaNO3 2g 葡萄糖1g • 3.对比试验:酵母浸液0.5g 蛋白胨1g 葡萄糖1g • 4.配置完毕调PH值 PH等于5为准确 • 包三个移液管然后将以上培养基一起拿去灭菌
接种培养
• 将种子液按9%的接种量接种到以下发酵瓶中 • （NH4）2SO42%+5ml种子液 • （NH4）2SO44%+5ml种子液 • NH4NO32%+5ml种子液 • NH4NO34%+5ml种子液 • NaNO32%+5ml种子液 • NaNO34%+5ml种子液
2、种子培养
挑取单菌落接至种子瓶，进行种子培养 培养条件：将250ml三角瓶装培养基60ml放 入摇床，将转速为180r/min,温度为30度 培养时间:12月4号早上10:37到12月5号早上 8:47十个小时左右
氮源的优化方案
1.常见的有机氮源:(NH4)2SO4.NH4NO3.NaNO3 2.准备7个三角瓶分别装入以下培养基然后定容至 50ml (1) 1.酵母浸液0.5g (NH4)2SO4 1g 葡萄糖1g 2. 酵母浸液0.5g (NH4)2SO4 2g 葡萄糖1g (2) 1.酵母浸液0.5g NH4NO3 1g 葡萄糖1g 2. 酵母浸液0.5g NH4NO3 2g 葡萄糖1g
• 5.7重新调整进风量，保持罐压在0.05MPa。 • 注意事项：操作中动作要迅速，罐压不得跌零， 否则会导致染菌。 • 6、取样 • 6.1打开取样放料阀处的蒸汽阀，微开取样放料阀， 保持10min后关闭两阀门。 • 6.2打开底阀和取样放料阀，放出少量培养液后关 闭取样放料阀。 • 6.3用酒精火焰封取取样放料口，把无菌取样瓶口 置于酒精火焰上拔去瓶盖，打开取样放料阀取好 样后，立即盖上瓶盖同时关闭底阀。
• 3.4 按工艺要求调整好PH后，拧紧进料口螺盖。 • 操作注意；实消时蒸汽冷凝水约占培养基体积 10%左右，固定容是必须扣除此容积。
• 4 、培养基实消
• 4.1 投料结束后，启动电机。慢速搅拌。 • 4.2 微开夹套排污阀，打开夹套蒸汽阀，保持夹 套压力为0.11mpa左右，待培养基预热达到95℃ 以上时停搅拌，关闭夹套蒸汽阀，开大夹套排污 阀。 • 4.3 培养基温度达到95 ℃后，缓慢打开进气阀及 底阀处的蒸汽阀，同时向罐内进气，待罐压升至 0.11mpa后，打开罐面排气阀进行排气。
• 6.4再次打开取样处放料阀处的蒸汽阀，对取样放 料阀口再灭菌，保持时间10min后关闭两阀。 • 注意事项：若不需要取无菌样时，可不进行酒精 火焰保护的操作。整个培养过程的总取样量一般 不超过发酵液体积的10%，否则诸如氧传递速度 等会受到影响。
1、NB型空气过滤器消毒
• 1.1在发酵罐空消前，必须对设备的NB型过滤器先 进行消毒； • 1.2为防止蒸汽冷凝水进入NB型过滤器，消毒前必 须先打开过滤器底部的排污阀，排尽冷凝水，时 间控制不少于5min； • 1.3NB型过滤器的消毒温度控制在120℃-123℃之 间，压力维持在0.11Mpa-0.12Mpa之间，时间确 保在25min-30min之间； • 1.4消毒后，在关闭蒸汽阀的同时迅速打开过滤器 的进气阀换气，并用压缩空气将过滤器吹干，吹 干时间一般控制在25min-30min之间； • 1.5吹干后，必须对整个空气进气系统进行保压， 压力维持在0.12Mpa-0.15Mpa之间。 • 操作注意：空气流量计内不能通入蒸汽，NB过滤 器消毒前必须将空气流量计出口阀关闭，以免造 成设备损坏。
稀释10倍
0.117A 0.105A 0.097A 0.061A 0.130A 0.143A 0.178A
原液
1.018A 0.863A 0.889A 0.830A 0.845A 0.836A 1.180A
测发酵瓶的PH值OD值 及残糖量
• 一小时后（12：30） • PH值均为5 • OD值 • 稀释 （NH4）2SO4 2% 0.210A （NH4）2SO4 4% 0.167A NH4NO3 2% 0.192A • NH4NO3 4% 0.106A • NaNO3 2% 0.167A • NaNO3 4% 0.161A • 对比 0.262A
• 4.8 当培养基温度达到发酵需要的温度后，关闭 夹套手动进水阀，调整转速至正常转速，将控制 系统切换至‘自动；运行状态，调整进风量、罐 压，等待接种。 • 操作注意；因为调压过滤器出口空气压力在 0.12mpa-0.15mpa之间，所以必须在发酵罐压力 降至0.1mpa以下时方可进行唤起操作，且必须先 换气后降温，防止设备失压。