亲和层析优秀课件
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亲和层析优秀课件
第一节 亲和层析概述
• 利用生物分子间专一的亲和力而进行分离 的一种层析技术
• 配体固定化的问题 • 在生物分离中有广泛的应用
历史
• 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉 酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的 实例。
• 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配 体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
• 目前主要用于分离与核酸有关的物质，如用寡聚 脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液 中的mRNA。
• 市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以 及珠状纤维素。
2. 琼脂糖凝胶
• 是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相互结合的链 状多糖，用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。
• 琼脂糖浓度有2%、4%、6%几种，相应的商品称 为Sepharose2B、4B和6B(Pharmacia)和 Ultrogels A-2，A-4，A-6(LKB)。这类载体能使 吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能 基团，结构疏松孔径大，流速快。
• 用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免 疫检测法，特别适用于检测含量低微的样品[4]， 免疫检测法利用被标记的抗体或模拟分析物来进 行间接的被分析物的分析。常用标记如酶标记、 荧光标记、化学荧光等。
固定化金属离子亲和层析
• 是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸 附蛋白质的分离系统。
• 目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组 氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚 基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合， 这是IMAC用于蛋白质分离纯化的根据[5,6]。
• 1967年Axen等用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋 白质的方法，并成功地制备了固定化酶。此技术 的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层 析技术得到了快速的发展。
• 生物大分子的分离
第二节 亲和层析基本原理及理论基础
• 亲和力 • 配体 • 固定相 • 原理：将具有亲和力的两个分子中一个固
定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的 特异性和可逆性，对另一个分子进行分离 纯化。
• 金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的 咪唑基及半胱氨酸的巯基结合。含有不同数量的 这些基团的蛋白质可以通过金属离子亲和层析得 到分离。
拟生物亲和层析
• 是利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或 某特定部位。以人工合成的配基为固定相吸附目 的蛋白质的亲和层析，
• 如以染料亲和层析（DAFC）和氨基酸(包括多肽) 亲和层析(AALA)[7]。染料配基，例如三嗪 （triazine）或三苯甲烷化合物[8]，能通过共价 键牢固地结合到亲和载体上。
（二）常用载体
• 纤维素 • 琼脂糖凝胶 • 聚丙烯酰胺凝胶 • 葡聚糖凝胶 • 多孔玻璃珠
1. 纤维素
• 它是自然界中数量最大的大分子生物材料，取材 十分方便。
• 但由于纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分 子的渗入。活化后因带有电荷，非特异性吸附力 较强，加上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载 体广泛。
• 染料配体与很多蛋白以及酶的活性位点相互作用， 以模仿这些生物分子的底物、辅助因子或结合剂 的形式进行。
四、亲和层析载体
载体在亲和层析中的作用： 使配基固定化、空间环境
• （一）亲和层析对载体的要求 • 载体要具有足够数量的功能基团 • 有较好的理化稳定性和生物惰性 • 有高度的水不溶性和亲水性 • 有多孔的立体网状结构
• 通常具有高的选择性。 • 典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素
-受体等。
免疫亲和层析
• 利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方 的分离系统，称免疫亲和层析。
• 免疫亲和层析应用相当广泛，许多典型的亲和层 析纯化蛋白质的过程已经使用了单克隆抗体作为 亲和配体。目前，利用抗体－抗原模式，有可能 得到每一种目标蛋白的单抗，然后以单抗为配基， 通过亲和层析技术分离纯化目标蛋白质。此种方 法的纯化倍数活性回收率非常高。
• 被固定在基质上的分子称为配体，eg:底物 类似物或竞争性抑制剂,抗原
• 配体和基质是共价结合的，构成亲和层析 的固定相，称为亲和吸附剂. Eg:Sepharose ,
一、亲和层析基本原理
分离原理
• 将制备的亲和吸附剂装柱平衡， • 当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分
离的生物分子就与配体发生特异性的结合， 从而留在固定相上； • 而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相 中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只 有待分离的生物分子。 • 通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来， 就得到了纯化的待分离物质
亲和力
• 生物分子间存在很多特异性的相互作用， 如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑 制剂、激素－受体等等，它们之间都能够 专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲 和力。
亲和作用的本质：钥匙和锁孔的关系 静电作用 氢键 疏水性相互作用 配位键 弱共价键
配体 与 固定相
• 亲和层析的分离原理简单的说就是通过将 具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶 性基质上，利用分子间亲和力的特异性和 可逆性，对另一个分子进行分离纯化。
• 亲和层析是利用生物分子所具有的特异的生物学 性质－亲和力来进行分离纯化的。由于亲和力具 有高度的专一性，使得亲和层析的分辨率很高， 是分离生物大分
• 生物亲和层析 • 免疫亲和层析 • 固定化金属离子亲和层析 • 拟生物亲和层析
生物亲和层析
• 利用自然界中存在的生物特异性相互作用 物质对的亲和层析。
二、亲和层析的特点
• 分辨率很高 • 分离速度快 • 操作简便 • 对设备要求不高 • 亲和吸附剂通用性较差 • 洗脱条件较苛刻
与其他层析技术比较
• 吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是 利用各种分子间的理化特性的差异，如分子的吸 附性质、分子大小、分子的带电性质等等进行分 离。
• 由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以 这些方法的分辨率往往不高。要分离纯化一种物 质通常需要多种方法结合使用，这不仅使分离需 要较多的操作步骤、较长的时间，而且使待分离 物的回收率降低，也会影响待分离物质的活性。
第一节 亲和层析概述
• 利用生物分子间专一的亲和力而进行分离 的一种层析技术
• 配体固定化的问题 • 在生物分离中有广泛的应用
历史
• 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉 酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的 实例。
• 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配 体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
• 目前主要用于分离与核酸有关的物质，如用寡聚 脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液 中的mRNA。
• 市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以 及珠状纤维素。
2. 琼脂糖凝胶
• 是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相互结合的链 状多糖，用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。
• 琼脂糖浓度有2%、4%、6%几种，相应的商品称 为Sepharose2B、4B和6B(Pharmacia)和 Ultrogels A-2，A-4，A-6(LKB)。这类载体能使 吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能 基团，结构疏松孔径大，流速快。
• 用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免 疫检测法，特别适用于检测含量低微的样品[4]， 免疫检测法利用被标记的抗体或模拟分析物来进 行间接的被分析物的分析。常用标记如酶标记、 荧光标记、化学荧光等。
固定化金属离子亲和层析
• 是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸 附蛋白质的分离系统。
• 目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组 氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚 基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合， 这是IMAC用于蛋白质分离纯化的根据[5,6]。
• 1967年Axen等用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋 白质的方法，并成功地制备了固定化酶。此技术 的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层 析技术得到了快速的发展。
• 生物大分子的分离
第二节 亲和层析基本原理及理论基础
• 亲和力 • 配体 • 固定相 • 原理：将具有亲和力的两个分子中一个固
定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的 特异性和可逆性，对另一个分子进行分离 纯化。
• 金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的 咪唑基及半胱氨酸的巯基结合。含有不同数量的 这些基团的蛋白质可以通过金属离子亲和层析得 到分离。
拟生物亲和层析
• 是利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或 某特定部位。以人工合成的配基为固定相吸附目 的蛋白质的亲和层析，
• 如以染料亲和层析（DAFC）和氨基酸(包括多肽) 亲和层析(AALA)[7]。染料配基，例如三嗪 （triazine）或三苯甲烷化合物[8]，能通过共价 键牢固地结合到亲和载体上。
（二）常用载体
• 纤维素 • 琼脂糖凝胶 • 聚丙烯酰胺凝胶 • 葡聚糖凝胶 • 多孔玻璃珠
1. 纤维素
• 它是自然界中数量最大的大分子生物材料，取材 十分方便。
• 但由于纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分 子的渗入。活化后因带有电荷，非特异性吸附力 较强，加上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载 体广泛。
• 染料配体与很多蛋白以及酶的活性位点相互作用， 以模仿这些生物分子的底物、辅助因子或结合剂 的形式进行。
四、亲和层析载体
载体在亲和层析中的作用： 使配基固定化、空间环境
• （一）亲和层析对载体的要求 • 载体要具有足够数量的功能基团 • 有较好的理化稳定性和生物惰性 • 有高度的水不溶性和亲水性 • 有多孔的立体网状结构
• 通常具有高的选择性。 • 典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素
-受体等。
免疫亲和层析
• 利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方 的分离系统，称免疫亲和层析。
• 免疫亲和层析应用相当广泛，许多典型的亲和层 析纯化蛋白质的过程已经使用了单克隆抗体作为 亲和配体。目前，利用抗体－抗原模式，有可能 得到每一种目标蛋白的单抗，然后以单抗为配基， 通过亲和层析技术分离纯化目标蛋白质。此种方 法的纯化倍数活性回收率非常高。
• 被固定在基质上的分子称为配体，eg:底物 类似物或竞争性抑制剂,抗原
• 配体和基质是共价结合的，构成亲和层析 的固定相，称为亲和吸附剂. Eg:Sepharose ,
一、亲和层析基本原理
分离原理
• 将制备的亲和吸附剂装柱平衡， • 当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分
离的生物分子就与配体发生特异性的结合， 从而留在固定相上； • 而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相 中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只 有待分离的生物分子。 • 通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来， 就得到了纯化的待分离物质
亲和力
• 生物分子间存在很多特异性的相互作用， 如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑 制剂、激素－受体等等，它们之间都能够 专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲 和力。
亲和作用的本质：钥匙和锁孔的关系 静电作用 氢键 疏水性相互作用 配位键 弱共价键
配体 与 固定相
• 亲和层析的分离原理简单的说就是通过将 具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶 性基质上，利用分子间亲和力的特异性和 可逆性，对另一个分子进行分离纯化。
• 亲和层析是利用生物分子所具有的特异的生物学 性质－亲和力来进行分离纯化的。由于亲和力具 有高度的专一性，使得亲和层析的分辨率很高， 是分离生物大分
• 生物亲和层析 • 免疫亲和层析 • 固定化金属离子亲和层析 • 拟生物亲和层析
生物亲和层析
• 利用自然界中存在的生物特异性相互作用 物质对的亲和层析。
二、亲和层析的特点
• 分辨率很高 • 分离速度快 • 操作简便 • 对设备要求不高 • 亲和吸附剂通用性较差 • 洗脱条件较苛刻
与其他层析技术比较
• 吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是 利用各种分子间的理化特性的差异，如分子的吸 附性质、分子大小、分子的带电性质等等进行分 离。
• 由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以 这些方法的分辨率往往不高。要分离纯化一种物 质通常需要多种方法结合使用，这不仅使分离需 要较多的操作步骤、较长的时间，而且使待分离 物的回收率降低，也会影响待分离物质的活性。