亲和层析的应用

亲和层析的应用
Chitin
几丁质
Trypsin
胰岛素
CHOM
鸡蛋粘多糖蛋白
亲和层析法分离胆固醇氧化酶
季文明,陈毅力等
江南大学生物工程学院
亲和层析法分离胆固醇氧化酶
胆固醇氧化酶是一种多功能酶。目前,医院
应用胆固醇氧wenku.baidu.com酶检测血清胆固醇含量。 胆固醇氧化酶可以降低食品中的胆固醇含 量；能有效抑制鳞翅目昆虫的生长繁殖,是 一种生物杀虫剂；胆固醇的氧化产物胆甾4-烯-3-酮还具有抗肥胖、治疗肝病等药效。
酶和酶的抑制剂纯化
使用亲和层析法纯化酶，可以得到相当好
的效果。例如，要分离猪和牛的胰蛋白酶， 可以连接鸡卵黏蛋白（胰蛋白酶的抑制剂） 与Sepharose 4B当作层析柱材质，用它纯 化出来的胰蛋白酶相当于5次再结晶的纯度。 除了使用抑制剂当配体，也可以反过来用 酶作为配体来纯化抑制剂，例如，将胰蛋 白酶接到Sepharose上，能有效分离纯化 大肠杆菌中的胰蛋白抑制剂Ecotin。
亲和层析的应用
亲和层析
亲和层析（affinity
chromatography）是 利用待分离物质和它的特异性配体间具有 特异的亲和力，从而达到分离目的的一类 特殊层析技术。 亲和层析法具有多方面的应用。
核酸的纯化
因为DNA与RNA之间具有专一性的亲和力，
所以亲和层析可应用于核酸的研究，例如 从大肠杆菌的RNA混合物中分离出专一于 噬菌体T4 的RNA，可将T4的DNA以共价 键结方式接于cellulose材质的管柱中，再 将所要的RNA分离出。 此外，根据核酸与蛋白质之间交互作用的 原理，可以将单股DNA接在Sepharose上， 纯化DNA聚合酶或RNA聚合酶。
亲和层析法分离胆固醇氧化酶
发酵产物经过盐析操作以后，得到层析用
样品。 他们利用一种脂溶性凝胶SepherdexLH20 作为胆固醇的载体,其分离的分子量小于 3000。胆固醇也为脂溶性的化合物,与凝胶 LH20有很好的相容性,而酶蛋白不能进入凝 胶。
亲和层析法分离胆固醇氧化酶
他们每次进行实验时加入1~5ml的样品,用
激素受体的纯化
激素受体是细胞膜上与特定激素结合的成
份，激素和受体的作用具有特异性，目前 用亲和层析法已经能够将激素与sephrose 的组合，纯化胰岛素、正甲状腺素的受体。
抗体与抗原的纯化

抗体与抗原结合具有高度专一性， Sepharose是这一类亲和层析较佳的载体， 由于抗原-抗体复合物的解离常数很低， 因此抗原在固定化抗体上被吸附后，要尽 快将它洗出，冲洗液的条件通常是控制 pH值至3以下，成份为醋酸、盐酸、TrisHCl缓冲液、20% 甲酸或1mol/L 丙酸， 也有使用尿素这一类的蛋白质变性剂作为 洗出用的溶液。
1~5倍体积的缓冲液A洗去杂物,流速为 0.5~2ml/min；然后再用缓冲液B洗脱酶蛋 白,流速为015~2ml/min。
亲和层析法分离胆固醇氧化酶
他们对表面活性剂的浓度和洗脱速度的条
件进行了考察，得到用亲和层析分离纯化 胆固醇氧化酶,酶比活从0.45U/mg提高到 15.5U/mg。亲和层析的适合条件为洗脱液 A的流速是015ml/min,洗脱液B的流速是 210ml/min。 实验室内可用此法分离纯化胆固醇氧化酶, 但是从实际操作和经济角度考虑，该法不 适合大规模处理。
谢谢大家！