第八章 植物基因的克隆原理与技术

myeloblastosis virus, M-MLV）
AMV的性质 由和两条多肽链组成。
聚合酶活性和 RNaseH活性。
RNaseH：
经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以5’3’或3’5’
方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。
RNA DNA RNaseH RNA DNA
逆转录酶的用途
Bgl II 5’-A GATCT-3’ 3’-TCTAG A-5’
经同尾酶消化的DNA末端连接示意图
BamH I
5’ XXXXGGATCCXXXXXX 3’
Bgl II
5’ XXXXAGATCTXXXXXX 3’
3’ XXXXCCTAGGXXXXXX 5’
5’ XXXXG GATCCXXXXXX 3’
大肠杆菌DNA聚合酶
Klenow fragment
T7 DNA聚合酶
T4 DNA聚合酶
Taq聚合酶
逆转录酶
常用DNA聚合酶的特性比较
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶
3’5’ 外切酶活性
低
5’3’ 外切酶活性
有
聚合 速率
中
持续能 力
低
Klenow fragment
T4DNA聚合酶 T7DNA聚合酶 逆转录酶 Taq DNA聚合酶
1、DNA连接酶作用的机理 2、DNA连接酶的反应条件 3、DNA连接的策略
DNA连接酶的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双
链连接到一起的酶。
DNA连接酶:由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能
源辅助因子。
T4DNA连接酶:由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅 助因子。 容易制备，而且可以连接完全配对的平末端DNA分子，所以
Hsu I
Sma I
同尾酶(isocaudamers):识别的靶序列不同，但能产生相同 粘性末端的一类限制性核酸内切酶。 注 意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接， 但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段 将不能被该两种酶的任一种所识别。
BamH I 5’- G GATCC -3’ 3’- CCTAG G -5’
限制性核酸内切酶的分类
限制性内切核酸酶类型：
目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。
I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶
不同类型核酸内切酶主要特性的比较分析
I 型 限制-修饰活性 内切酶的蛋 白质结构 活性辅助因子 甲基化位点 特异性切割 基因克隆中的 用途 单一多功能的 酶 3种不同亚基 II 型 限制酶和修饰酶 分开 单一成分 III 型 双功能酶 2种不同亚基 ATP、Mg2+、 SAM 否 用途有限
2– 反转录酶的发现和应用
1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完 善了中心法则，使单个真核基因的制备成为了可能。
3– 载体的发现和应用
1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实 现了DNA的体外重组。
3– 载体的发现和应用
1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组 实现了细菌间性状的转移。 这一年被定为基因工程诞生的元年。
合成cDNA
以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。
mRNA 5’ AAAAAA TTTTTT
3’ 5’
RT-PCR用的模板
克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。
mRNA 5’ AAAAAA TTTTTT
3’ 5’
DNA修饰酶
末端脱氧核苷酸转移酶 T4多核苷酸激酶 碱性磷酸酶
1– 工具酶的发现和应用
Werner Arber 1968年发现限制酶
Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II， 1972年，Boyer等相继发现了ＥcoR I 一类重要的限制性内 切酶。
1– 工具酶的发现和应用
1967年，世界上五个实验室几乎同时发现DNA连接酶， 特别是1970年Khorana等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连 接活性。
如Hind Ⅲ和Hsu I
Hind Ⅲ 5’-A AGCTT-3’ 3’-TTCGA A-5’ 5’-A AGCTT-3’ 3’-TTCGA A-5’
如Xma I 和 Sma I
Xma I 5’-C CCGGG -3’ 3’-GGGCC C-5’ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’
Bgl II
3’ XXXXTCTAGGXXXXXX 5’
限制性核酸内切酶的消化反应
影响酶活性的因素很多： DNA的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素 纯度的鉴定：紫外吸光值A260/A280 浓度低于500ng/ L 酶切消化的缓冲液 Mg2+ Tris-HCL BSA（牛血清蛋白） 酶切反应的温度（通常为37℃） 影响酶切消化的其他因素 时间 体积 RNA
3、II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、限制性核酸内切酶的消化反应
限制性内切核酸酶的发现 50年代发现了大肠杆菌具有对付噬菌体和外来DNA的限制 系统； 60年代后期证明了细菌的限制和修饰系统； 1968年，Meselson 和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限 制性核酸内切酶；
1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一 个II型限制性核酸内切酶Hind II，使得DNA分子的体外精确 切割成为可能。
催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。 5’ P5’ HO碱性磷酸酶
-OH 3’ -P 3’
-OH 3’ -OH 3’
5’ HO5’ HO-
碱性磷酸酶的功能
防止线性化的载体份子自我连接
5’AAGCTT TTCGAA 5’
HindⅢ酶切
A-OH 5’P-AGCTT TTCGA-P5’
酶切反应的基本步骤
－
CK T M CK T M
加反应液
37℃ 1h
Βιβλιοθήκη Baidu
电泳
紫外分析
＋
Buffer (10×) 2.0 L
Water
DNA Enzyme Volume
16.5 L
1.0 L 0.5 L 20.0 L
1.0kb 1.0kb 0.6kb 0.5kb 0.4kb
DNA连接酶及其应用
ATP、Mg2+、 Mg2+ SAM 寄主特异性的位点 否 用途有限 是 十分广泛
II型限制性核酸内切酶的3大特点
识别位点的特异性 识别序列的对称性 切割位点的规范性
与II型核酸内切酶有关的几个概念
粘性末端 ( cohesive ends )：因酶切位点在两条DNA单链上不同 （对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产 生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。
限制（Restriction）
修饰（Modification）
限制性内切酶将侵入细菌体内 细菌自身的DNA碱基被甲基化 酶甲基化修饰所保护，不能被 的外源DNA切成小片断。 自身的限制性内切酶识别切割。
限制性核酸内切酶（ Restriction endonucleases）：是一
类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能
P
OH
CCGAATTCGG GGCTTAAGCC
磷酸化
CCGAATTCGG GGCTTAAGCC
OH
P
OH
OH
P
P T4连接酶
P
OH
OH
CCGAATTCGG GGCTTAAGCC CCG GGCTTAA
CCGAATTCGG GGCTTAAGCC P
EcoR I
AATTCGG GCC
DNA聚合酶及其应用
5’端凸出（如EcoR I）
3’端凸出（如Pst I）
平 末 端 (Blunt end)：因酶切位点在两条DNA单链上相同， 酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起 来。
同裂酶 (isoschizomers )：能识别和切割同样的核苷酸靶序
列的不同内切酶。 完全同裂酶 识别位点和切点完全相同 不完全同裂酶 识别位点相同但切点不同
第八章 植物基因的克隆原理与技术
• 内容 • 一．基因克隆所需要的酶和载体 • 二．植物转化载体的构建 • 三．基因克隆的方法
基因克隆所需要的酶和载体
一般认为 基因工程诞生于1973年 上世纪40年代——70年代初 分子生物学领域
理论上的三大发现和技术上的三大发明
对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。
限制性核酸内切酶的概念
精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300
种微生物中分离出了2300种，其中商品化的限制性核酸内切 酶500余种。
限制性核酸内切酶的命名
1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜
体字母的略语表示酶来源的菌种名称。
如：大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco ； 属名 种名
植物基因工程的基本流程
提取
目的DNA
酶切
DNA片段 载体
导入到细菌中
重组菌的筛选
序列分析和基因表达等研究
基因克隆所需要的酶类 • • • • • • 限制性内切核酸酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 核酸外切酶 单链DNA内切酶
“ ”
限制性核酸内切酶
1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的命名和分类
影响连接效率的因素有： 温度（最主要的因素） dNTP的浓度(10M-1M) 连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高） 反应时间（通常连接过夜） 插入片段和载体片段的摩尔比
重组菌
平末端DNA片段的末端加尾连接法
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’
+dATP
5’
末端核苷酸转移酶
3’ 5’
+dTTP
5’ 3’
AAAAA 3’ 3’ 5’ DNA聚合酶和 T4DNA连接酶
TTTTT 3’
5’
平末端DNA片段加接头连接法
衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷 酸的DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔 接物和目的片段的5′端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用T4DNA 连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的DNA片段。
在基因克隆中应用广泛。
DNA连接酶作用的特点
A. 连接的两条链必须分别具有 3′端自由羟基（-OH）
和5′端磷酸基团（-P），而且只有这两个基团彼此相邻时
才能进行连接反应；
B. 连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，
即ATP和NAD+。
DNA连接反应的条件
CK加反应液 4℃ 过夜
转化 CK+
低
高 高 无 无
无
无 无 无 有
中
中 快 低 快
低
低 高 中 高
逆转录酶
一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为
cDNA (complementary DNA)。实际上，是一种RNA依赖的
DNA聚合酶。
来源 RNA肿瘤病毒。
最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian
myeloblastosis virus, AMV）和鼠白血病毒反转录酶（avian
3’ XXXXTCTAGAXXXXXX 5’
5’ XXXXA GATCTXXXXXX 3’
3’ XXXXCCTAG
GXXXXXX 5’
5’ XXXXA
3’ XXXXTCTAG
GATCCXXXXXX 3’
AXXXXXX 5’
3’ XXXXTCTAG
GXXXXXX 5’
BamH I
5’ XXXXAGATCCXXXXXX 3’
流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为Hin；
2、修饰性酶用M表示，限制性酶用R表示 如 R. Hin M. Eco 3、用一个正体字母表示菌株的类型 如Escherichia coli RY13 Eco R 4、以罗马数字表示分离出来的先后顺序 如Eco R I、 Hin d III
1-- DNA是遗传物质被证实
1944年，Avery O.T.肺炎双球菌转化实验
2-- DNA双螺旋模型的提出
Watson 和Crick
1953年，James Watson 和Francis Crick提出 了DNA的双螺旋模型。
3– “中心法则”的提出
以Nireberg等为代表的一批科学家 确定了遗传信息以密码方式传递， 每三个核苷酸组成一个密码子，代 表一个氨基酸，到1966年，全部破 译了64个密码子，并提出了遗传信 息传递的“中心法则”。
细菌性碱性磷酸酶 Bacterial alkaline phosphatase，BAP 从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。 碱性磷酸酶 小牛肠碱性磷酸酶 Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP 从小牛肠中纯化出来。SDS中加热68℃可完全 失活。
碱性磷酸酶的特性：