植物表达载体构建

2．常用的中间载体及其构建： （1）广谱中间载体： 所谓广谱中间载体是由大肠杆菌广谱质粒克隆 T-DNA片段后 构建而成的。常用的广谱质粒是 RK2 衍生的载体 pRK290 。 由它构建的中间载体既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌 中复制。
广谱中间载体的构建过程见下图。 ①将选定的T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒上； ②将外源基因连同细菌选择标记（如抗生素抗性）一起插入 到T-DNA片段的限制性切点中； ③将产生的 T-DNA“ 工程”片段亚克隆或共整合到广谱质粒 pRK290。 由于 pRK290 具有在广寄主范围中复制和接合转移的起点， 因而在辅助质粒如 pRK2013 反式动员作用下， pRK290 即可 从大肠杆菌转入根癌农杆菌中。
（ 1 ）共整合系统中间载体：含有与 Ti 质粒 T-DNA 区同源的 序列，此外含有pBR的序列，在其被引入农杆菌后即可高频 地与Ti质粒的T-DNA的同源序列进行重组；具有一个或多个 细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；具有 bom位点 （接合转移位点），在有诱导质粒存在的情况下，bom位点 的存在可使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；含有植物 阳性选择标记，例如可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性的新 霉素磷酸转移酶（neomycin phosphoransferase，Npt-II）基 因，以利于转化植物细胞的筛选；含有单一的限制性内切酶 切点，以利于外源基因的插入；无 Ti 质粒的边界序列 ( 见下 图 )。 （ 2 ）双元载体系统中间载体：其与共整合载体的不同之处 是：无同源序列；具有LB和RB；无ColE复制点。
（四）植物基因转化载体系统的构建：
上述构建的中间表达载体仍然不能直接作为植物外 源基因转化的载体，因为中间表达载体仍是一种细菌 的质粒，不能把外源基因转化到植物细胞。因此，必 须进一步把中间载体引入到上述已改造的受体 Ti 质粒 中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体，才能 应用于植物基因的转化。它是由两种以上质粒构成的 复合型载体，故称之为载体系统。
第五节
植物基因工程载体
在植物基因转化研究中已建立了多种转化系统， 如载体转化系统、原生质体DNA直接导入转化系统、基因 枪DNA导入转化系统，以及利用植物种质细胞如花粉粒等介 导转化系统等等。 其中的载体转化系统是植物基因工程中最重要的一种转化 系统。 载体转化系统中最重要的又是Ti质粒转化载体。
一．植物基因工程载体种类及命名规则： 二．根癌农杆菌Ti质粒的结构和功能： （一）Ti质粒的遗传特性、结构及功能： （二）T-DNA的基因结构与功能： 三．农杆菌Ti质粒的基因转化机理： （一）T-DNA的加工和转移： （二）T链蛋白复合体的形成及VirE的功能： （三）T链复合体通过细菌膜的转运及VirB的功能： （四）T链复合体靶向植物细胞核： （五）T链整合植物基因组的分子机理： （六）农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控： 四．农杆菌Ti质粒的改造及载体构建： （一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建： （二）中间载体的构建： （三）中间表达载体的构建： （四）植物基因转化载体系统的构建： （五）载体构建中常用的选择基因和报告基因
（2）pBR322衍生的中间载体：
这类中间载体含有 pBR322 质粒的部分序列，是 由 pBR322 质粒或其衍生质粒亚克隆 T-DNA 片段而形 成。其构建方法类似于上述广谱中间载体。由于 pBR322质粒上带有pMB1的bom转移接合位点，因而 在辅助质粒如 R64drd11 的帮助下，这种 pBR322 衍生 的中间载体能够导入农杆菌中的 Ti 质粒。 pBR322 质 粒只有与 Ti 质粒重组后得以生存，未重组的 pBR322 不能在根癌农杆菌中复制而自行消失。
四．农杆菌Ti质粒的改造及载体构建
（一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建：
（二）中间载体的构建： 1．中间载体的基本结构与特点 2．常用的中间载体及其构建 1．中间载体的基本结构与特点： 为解决Ti质粒不能直接导入目的基因的困难，构建中 间载体是有效方法之一。中间载体是在大肠杆菌的克隆 载体（例如pBR322质粒）中插入一段合适的 T-DNA片段 而构成的小型质粒。中间载体通常是多拷贝的E.Coli小质 粒。 从结构特点上看，中间载体可分为两类： 共整合系统中间载体 双元载体系统中间载体
（1）共整合载体的构建 第一步：中间载体导入农杆菌：通常有两种方法: 即接合转移法（conjugative transfer）和三亲杂交转移法。 1）接合转移法是由于大肠杆菌质粒衍生出来的中间表达载体 均为接合缺陷型（非接合型），不能自主转移，只有在具 有接合转移功能的协助质粒存在时才能被动地完成转移。 根据中间载体是否有 recA 依赖性重组和协助质粒本身是否 转移，可将中间载体的接合转移分为传导（ conduction ） 和供给（donation）两种类型。
（六）农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控： 目前已发现位于细菌染色体上的一些基因也与 T-DNA 的转移有关，并已经了解它们编码的蛋白质的功能。 ChrA、ChrB和ChrC均参与细菌的附着功能。还有一些 基因（ Cel 、 Att 、 ivr 、 PscA 和 ExoC 等）在 T-DNA 转移 中起重要作用，这些基因的突变将使细菌表面成分发生 变化，从而丧失与植物细胞识别和结合的的能力。此外， ChrD 位点影响 AS 对毒性区的诱导效率和农杆菌的致瘤 能力。这是因为ChrD可能编码一种细菌ATP结合蛋白， 在低 pH 值和磷酸饥饿的情况下可诱导 VirG 的表达。 ChrE位点编码一个单糖结合蛋白，与单糖影响 Vir区的 表达有关。Ros基因与Vir基因的负调节有关。可见，目 前已知农杆菌染色体上游 10个基因与T-DNA的转移有关。
四．农杆菌Ti质粒的改造及载体构建
（一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建 （二）中间载体的构建 （三）中间表达载体的构建 （四）植物基因转化载体系统的构建 （五）载体构建中常用的选择基因和报告基因
（一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建： 由于大肠杆菌具有能与农杆菌高效接合转移的特性， 科学家们可以先把 T-DNA 片段克隆到大肠杆菌的质粒中， 并插入外源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农 杆菌的Ti质粒上。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒称为中 间载体（ intermediate vector ），而接受中间载体的 Ti 质 粒称为受体Ti质粒（acceptor Ti plasmid），一般是卸甲 载体（disarmed vector）。
（四）植物基因转化载体系统的构建： 1．一元载体系统的构建： （1）共整合载体的构建： 共整合载体的特点： ①中间表达载体与受体Ti卸甲载体通过同源重组共整合而成； ②共整合载体与受体Ti质粒之间的同源序列是pBR322。 以pGV3850为例说明其构建过程（图）： 第一步：中间载体导入农杆菌 接合转移法和三亲杂交转移法 第二步：中间载体与受体Ti质粒的同源重组： 第三步：共整合载体的选择：
目前采用的主要有两种载体系统：一元载体系统 和双元载体系统。
（四）植物基因转化载体系统的构建： 1．一元载体系统的构建： 这类载体是中间表达载体与改造后的受体 Ti质粒之间， 通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常亦称为共 整合载体（co-integrated vector，cis），由于该载体的TDNA 区与 Ti 质粒 Vir 区连锁，因此又称为顺式载体（ cisvector）。 一元载体的特点是：①由两个质粒（ E.Coli 质粒和 Ti 质粒）重组而成，分子量较大；②共整合体的形成频 率与两个质粒的重组频率有关，相对较低；③必须用 Southern 杂交或 PCR 对大的共整合体质粒进行检测；④ 构建时比较困难。 一元载体系统目前主要有两种：共整合载体和拼接末 端载体（split-end vect理： 1．整合位点及其特性 2．T-DNA整合的遗传效应： 位点效应：T-DNA可插入多个物理位点。遗传位点数一般少 于或等于插入的物理位点数，这是因为甲基化可使基因不表 达；或者，多拷贝插入不同位点或首尾串联在一起，可能相 互 起 作 用 而 导 致 基 因 的 沉 默 （ 被 称 为 共 抑 制 ， cosuppression）。 T-DNA的插入一般不引起植物 DNA大的重排，但多数插入 会导致靶位点处出现小的缺失，缺失多的可达79个核苷酸。 在 T-DNA/ 植 物 DNA 连接处 ， 有几个至 33 个核苷 酸 的 “填 充”DNA（Filler DNA）的存在，这些填充DNA的序列与靠 近连接处的植物DNA序列相似。 在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在 T-DNA两端和 植物靶位处之间有一段序列（5-10bp）同源，则可在整合中 起作用。
2．嵌合基因（chimeric gene）构建： 所谓嵌合基因就是来自两种或两种以上生物的启动 子、结构基因连接在一起而构成的基因。
3．中间表达载体的构建过程： 中间表达载体是由中间载体加上能在植物细 胞中表达的启动子和选择标记基因构成，也就是 嵌合基因插入中间载体后构成。所以中间载体的 构建是一个十分复杂的过程。
卸甲载体（disarmed vector） 1．Onc-卸甲载体： 所谓的卸甲载体就是无毒的（ non-oncogenic）、即切 除了 Onc 致瘤基因的 Ti 质粒载体。在这种 Onc- 载体中，已 经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用质粒pBR322取 代。这样，任何适合于克隆在质粒中的外源DNA片段，都 可以通过与 pBR322 质粒 DNA 的同源重组，而被共整合到 Onc-Ti质粒载体上。最常用的 Onc-卸甲载体为pGV3850， 它保留了两个边界和右边界附近的 nos基因（胭脂碱合成酶 基因），可作为鉴别转化细胞的一个标记； T-DNA内部的 Onc 缺失 区被 pBR322 序 列（ 含 Apr 基 因 ）所取 代 。插入 pBR序列可供卸甲载体和中间载体之间实现交换重组形成 共和体，即重组体。 2. Onc+卸甲载体： 不去除Onc基因的卸甲载体，用于特殊用途。
（三）中间表达载体的构建：
中间载体从功能上看可分为两大类：克隆 载体和表达载体。
克隆载体的主要功能是复制和扩增基因； 表达载体是适于在受体细胞中表达外源基 因的载体。
中间表达载体含有植物特异启动子，因而 能在植物中表达外源基因。
（三）中间表达载体的构建
1．启动子及其它调控序列：
转录的调控对真核生物基因表达起着关键的作用。大多 数真核生物在转录起始点的 5’ 端上游区第 30 至 25bp 处具有 TATA盒，在70至 80bp处还有 CAAT盒；3’ 端具有AATAA序 列。Ti质粒的Nos、Ocs、Tmr等基因都具有与真核生物启动 子类似的 TATA 盒和 CAAT 盒，均能在植物细胞中表达，且 无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子， 其中以Nos启动子（pNos）最常用。后来发现，由CaMV35s 启动子、外源结构基因和Nos 3’端的非编码区域组成的嵌合 基因，能在植物细胞中高效表达。 CaMV35s 启动子既无组 织特异性，又不受发育时期的影响，是一个较理想的植物基 因工程启动子。 现在已发现很多诱导启动子和特异表达的启动子，被用 于各种不同的转化目的。
（五）T链整合植物基因组的分子机理： 1．整合位点及其特性：
遗传作图的分析表明， T-DNA 在植物染色体上的插 入是随机的，可插入任何一条植物染色体。但插入位点 常有以下特点：① T-DNA 优先整合到转录活跃的植物基 因位点；②T-DNA与植物DNA连接处富含A、T碱基对；③ 植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的 同源性。Matsumoto等人认为，正是由于这种同源性才 使得插入的T-DNA和靶序列能互相靠近，并有效地发生 DNA链的交换。 在 T-DNA 的整合过程中还常发现植物基因组靶序列 的缺失、倒位和重复等现象，说明T-DNA的整合过程依 赖于植物内源重组系统。