何水林版基因工程第五章__基因的转移与重组体的筛选和鉴定

三、转化率及影响因素
例：某一 DNA 重组实验的重组率为 20% ，转化率为 107 cfu / mg 天然载体，经酶切和连接处理后的重组载 体转化率比天然载体约低 100 倍，欲获得 104 个重组克
隆，需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？
104 ＝ 107 cfu / mg ×10-2 × a × 20% 重组载体 a = 0.5 mg
先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其 5’端的磷酸，防止自我连接。
BamHI adapter
5’p-GATCCCGG-3’ GGCC-p5’ CIP处理 5’HO-GATCCCGG3’ GGCC-OH5’
nick缺口
Blunt-ended DNA -OH P-P HO-
T4 ligase
DNA
吸附
装入
外植体培养及选择
金属微粒加速，进入受体细胞
具 体 操 作
1. DNA微弹的制备
3. DNA微弹轰击
2. 外植体的制备
3. 电击法（电穿孔法） 纤维素酶 植物细胞
和果胶酶
原生质体
DNA
电击处理 选择培养
愈伤组织
混合入 电击缓冲液
分化
幼苗
二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞 （三）导入动物细胞
个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸
EcoR I linker：
GGAATTCC CCTTAAGG
（1）多核苷酸激酶处理
（2）T4连接酶连接
（3）限制性内切酶消化
（4）目的片段与载体连接
（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （ 3）DNA 接头 （adapter ）连接法
① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列） P-P 5’p-GATCCCGG-OH3’ 3’HO-GGCC-p5’
共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%
共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法
2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 酵母 0.1mol/L LiCl处理
感受态
热激
插入外源基因的载体
40% PEG 4000
涂布选择性平板，筛选转化子
吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍
转化率：103个 / g DNA；共转化现象极少
② 加尾－碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
③优点：
能把任何片
段连接起来
④缺点： 操作繁琐；
外源片段难以回收；
同聚物尾巴影响外源 基因表达。 非酶切位点
（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （2）衔接物（linker）连接
Linker： 用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
（2）电转化法 原理：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时 性微孔，重组 DNA 通过微孔进入细胞后，脉冲结 束，细胞恢复原状。 实验简单，不需要制备特殊的感受态细胞 “感受态”：清洗处理，在低温下使细胞处于 无离子区且有甘油或蔗糖等保护剂的悬液中，保证 电击过程中细胞不被击穿而死亡。
转化率：109~1010/ g DNA
三、 PCR 产物的连接 2. 与 T载体直接连接 PCR产物 载体
dNTP
A
Taq DNA聚合酶
dTTP T
A
T
TA
TA
三、Gateway 载体构建系统
噬菌体位点特异性重组系统； 高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。
入门克隆
改造过的各种表达载体
三、Gateway 载体构建系统
（1）创建入门克隆 BP反应：attB+attP attL+attR，产物：入门克隆
葡聚糖
4. DEAE-葡萄糖转染法
DEAE-dextran
混合 外源DNA 吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分 DNA 可以进入 到细胞核里。 DEAE-dextran对细胞有毒，常采用低浓度长时间处理 细胞
三、转化率及影响因素
转化率（cfu / μgDNA）：每微克重组DNA转化后，接 纳DNA分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。
源自文库
Blunt-ended DNA
5‘p-GATCCCGGGGCC-
BamHI adapter -CCGG -GGCCCTAG-P5’
② 优点：
连上后就能用。 ③ 缺点： 接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接 CCGG GGCCCTAG-p5’ 5‘p-GATCCCGGGGCC-
④ 防止自我连接
（一）转化（transformation）
（1）热激法（heat shock） （2）电转化法（electronporation） （3）PEG介导的原生质体转化 （4）接合转化
（1）热激法
制备感受态细胞
① 目的 增加受体菌细胞膜的通透性 感受态细胞：处于能吸 收外源DNA分子的生理 状态的细胞
三、转化率及影响因素
普通的亚克隆实验：1×10 6 cfu/μg DNA； 更复杂的亚克隆：1×107 cfu/μg DNA，如有限量的 DNA的转化，T-A克隆； 构建文库：> 1×108 cfu/μg DNA。
三、转化率及影响因素
（二）转化率的影响因素 1）载体DNA类型、大小；重组DNA浓度、纯度
1. 2. 3. 4. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导法 显微注射法 DEAE-葡萄糖转染法
（三）导入动物细胞
1. 磷酸钙沉淀法 原理： 通过磷酸钙-DNA共沉淀，将外源基因导入 哺乳动物细胞 依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10% 的细胞能吸收DNA沉淀。
操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
通过农杆菌侵染 植物外植体
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将含有外源目的基因的 TDNA整合到植物细胞基因 组中，获得转基因植株
叶 盘 法 的 具 体 操 作
在饲养平皿的滤 纸上培养2天
2. 基因枪法（gene gun） 又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微 粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。 1.2m钨弹头 外植体制备 基因枪 轰击
（一） 直接连接
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低， 只有粘性末端的1~10%。 5’ P3’ HO-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
5’ P3’ HO-
（二） 人工加尾形成 “粘性末端”
（1）同聚加尾法 ① 原理： DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
（二） 转
导
由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。 每g DNA能形成106个噬菌斑 （三） 转 染
噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接 被感受态细胞捕获的过程。 与转化无本质区别 现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染
体 外 包 装 过 程
第五章 基因的转移与重组体的 筛选和鉴定
第一节 DNA的体外重组
DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组 合的DNA称为重组DNA。 一、粘性末端的连接 DNA 连 接 酶 把 相 互 靠 近 的 5’ 端 磷 酸 与
3’-OH连到一起
单酶切、双酶切
二、平末端（blunt end）的连接
5’HO-GATCCCGGGGCC
CCGG -GGCCCTAG-OH5’
nick缺口 虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接 T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化
三、PCR产物的连接 1.在引物的5’端设计酶切位点 （1）设计原则
符合载体的多克隆位点；
避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构 3’端15～20bp与模板互补； 5’端内切酶识别序列＋保护碱基
三、PCR产物的连接 1.在引物的5’端设计酶切位点
请设计一对PCR引物，在 N端和C端分别加一个 EcoRI（GAATTC，保 护碱基GCA）和BamHI酶切位点（GGATCC，保护碱基CGC），另外 ，各含有 18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序 列。写出P1和P2的引物序列。
入门克隆
改造过的各种表达载体
√
三、Gateway 载体构建系统
（2）构建表达克隆 LR反应：attL+attR attB+attP，产物：表达克隆
入门克隆
改造过的各种表达载体
√
√
第二节 重组体导入受体细胞
一、重组DNA导入大肠杆菌
（一）转化（transformation） 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （二）转导（transduction） 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。 （三）转染（transfection） 受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
效果稳定，但转染效率低。
2. 脂质体介导法
脂质体包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。
3. 显微注射法
应用玻璃显微注射器，直接把外源DNA注射到宿主
细胞核里，使其整合到染色体上。
1）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段
2）收集受精卵：受孕后几小时内 3）显微注射：将外源基因注入受精卵的雄原核 4）受精卵移植
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
三、转化率及影响因素
例：取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态
细胞。向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复
一小段时间，取100μl铺板。培养过夜，产生1000个菌
落，转化率为多少？
转化率＝1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /μg
2）受体细胞
3）转化方法：同一转化方法技术参数影响转化率
第三节 重组子的筛选与鉴定
一、载体表型选择法 二、根据插入基因的表型选择 三、DNA电泳检测法 四、PCR检测法
五、核酸杂交检测法
六、免疫化学检测法
3. 种质系统法（花粉管通道法等）
（三）导入动物细胞
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将目的基因插入到载体 的T-DNA区，形成重组 DNA
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将 重 组 DNA 转 入 含 有 Vir致病基因的农杆菌
（二）导入植物细胞
（1）热激法 制备感受态细胞 ② CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理
1、将处于对数生长期的细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中，细 胞膨胀成球形，处于感受态； 2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase 的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；
3、经42℃短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物；
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
3. PEG1000转化 PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化 4. 电击转化
（1）适于原生质体和完整细胞
（2）转化率高，105个 / g DNA
（3）单链转化率高于双链
二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞
1. 载体介导的转化（农杆菌介导）
2. DNA直接导入（基因抢法、电击法等）
二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞
1. 原生质体转化 2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 3. PEG1000转化法
4. 电击法
（二）导入植物细胞
（三）导入动物细胞
1. 利用原生质体进行转化 酶去壁 酵母 CaCl2 PEG
原生质体
感受态 转化
插入外源基因的载体 转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受再生率影响