液态活检技术的发展及肿瘤领域的应用_陈颖
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1948 年 Mandel 和 Metais ［14］ 在 人 类 血 循 环 中 发 现 了 游 离 DNA 的 存 在 ，称 之 为 “Cell-free DNA” （cfDNA）。 此 后 ，cfDNA 的 检 测 开 始 增 多 ，尤 其 是 作 为 无 创 性 检 测 手 段 （non-invasive prenatal testing， NIPT）应用于 高危孕妇的 产前诊断 ，比如唐氏 综 合 症 、 ［15］ 先 兆 子 痫 等 ［16］ 。
分 子 诊 断 与 治 疗 杂 志 2015 年 11 月 第 7 卷 第 6 期 J Mol Diagn Ther， November 2015， Vol． 7 No． 6 · 363 ·
mL外 周 血 表 明 患 者 预 后 较 好 。 根 据 CTCs 的 含 量 与临床预后的关联其他还在研究阶段的磁珠包 被标记物如广谱标记物（全角蛋白）和其他肿瘤 类 型 相 关 标 记 物 如 CerBb2、Mucin、AFP 等 。 此 外 ， 用 于 分 离 CTCs 的 标 记 物 除 了 蛋 白 质 类 标 记 物 ， 还 包 括 了 mRNA 和 端 粒 酶 类 的 标 记 物 ［29］， 提 高 了 CTCs 的 检 出 效 率 。 但 是 肿 瘤 相 关 的 标 记 物 的种类非常繁杂， 并没有一个标记物能 “放之四 海而皆准”。 基于这些情况产生了阴性富集法。 所 谓阴性富集法是指磁珠结合得到的细胞不是所需 要的细胞， 主要应用了针对白细胞的广谱标记物 CD45，在 磁 场 作 用 中 剔 除 了 有 核 细 胞 游 中 的 白 细 胞 ， 其 中 未 被 结 合 的 细 胞 就 是 所 需 要 的 CTCs ［30］， 能 大 大 增 加 CTCs 的 检 出 数 量 。 但 是 免 疫 磁 珠 法 仍然受到标记物的限制， 由于肿瘤细胞与正常细 胞存在交叉抗原表达， 并且肿瘤细胞本身存在显 著 异 质 性 ， 同 一 个 患 者 得 到 的 CTCs 并 不 会 表 达 一致性的标记， 因此容易出现假阳性或假阴性的 结果。 2．1．2 CTCs 芯片技术
2 常用检测技术
2．1 CTCs 分离、富集相关技术 2．1．1 免 疫 磁 珠 富 集 法 （immunomagnetic beads separation， IMS）
IMS 技 术 基 于 细 胞 表 面 的 抗 原 与 连 有 特 异 性 抗体的磁珠相结合， 并在外源磁场的作用下富集 细胞， 其根据分离的策略可以分为阳性富集法和 阴性富集法两大类。 阳性富集法是指磁珠结合得 到的细胞就是所需要的细胞。 目前唯一已获得美 国食品药品 监 督 局 （Food and Drug Administration， FDA）批 准 上 市 的 CELLSEARCH誖循 环 肿 瘤 细 胞 检测试剂盒就是针对细胞表面的上皮细胞粘附分 子 （epithelial cell adhesion molecule， EpCAM） 来 分 离 CTCs。 该试剂盒提出了具有临床预后判断意义 的 CTCs 的检出数目： 转移性乳 腺癌和前列 腺中， CTCs 数目小 于 5 个 ／ 7．5 mL 外周血 表明患者 预 后 较 好 ； 转 移 性 大 肠 癌 中 ，CTCs 数 目 小 于 3 个 ／ 7．5
“液 态 活 检 ” 这 一 概 念 最 早 在 1974 年 由 Sorrells 等［2］提 出，当时 指 关 节 腔 的 滑 液 分 析 用 于 诊 断 滑膜疾病。 液态活检的标本来源主要为以血液为
主的体液，其中包括胸水、腹水等其他体液成分， 而血液是最容易获得的临床标本。 本文详细总结 了液态活检的对象、方法和应用领域，旨在为肿瘤 的诊断和治疗提供新的手段， 为病人的预后和转 归提供新的依据。
1 液态活检的研究对象
液态活检的研究对象主要包括外周血循环中 存 在 的 循 环 肿 瘤 细 胞 （circulating tumor cells， CTCs） 和 游 离 DNA （cell -free DNA，cfDNA） 两 大 类。
基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 （81172310） 作 者 单 位 ：第 二 军 医 大 学 附 属 长 海 医 院 病 理 科 ，上 海 200433 ★通 讯 作 者 ：朱 明 华 ， E-mail：mhzhu2000＠hotmail．com
分 子 诊 断 与 治 疗 杂 志 2015 年 11 月 第 7 卷 第 6 期 J Mol Diagn Ther， November 2015， Vol． 7 No． 6 · 361 ·
誗述 评誗
液态活检技术的发展及肿瘤领域的应用
陈颖 朱明华★
［摘 要］ 广义而言，液态活检是指以血液为主的体液标本中细胞及核酸的检测，包括了循环肿瘤 细 胞 和 游 离 DNA 两 大 类 。 液 态 活 检 属 于 新 型 的 无 创 性 分 子 病 理 检 测 方 式 ，具 有 广 阔 的 临 床 应 用 前 景 ；对 于传统病理学而言，液态活检的出现既是机遇也是挑战。 本文主要从分子检测技术以及临床应用价值这 两方面综合阐述了液态活检作为一种新的非侵入式的检测方法在临床肿瘤早期诊断、筛查等领域的发展 前景及面临的挑战。
[ABSTRACT] Liquid biopsy refers to the analyses of circulating tumor cells or cell-free fragments of DNA that mainly exist in the bloodstream and other body fluid. Liquid biopsy is a novel kind of non -invasive technique and has a wide prospect of clinical application in the molecular pathological field. The occurrence of liquid biopsy is both an opportunity and challenge towards traditional histopathology. In this paper, the advances in the emerging new techniques of liquid biopsy and its clinical application values in the field of cancer care, including prognosis assessment, early cancer screening and prediction of treatment responses will be reviewed.
· 362 · 分 子 诊 断 与 治 疗 杂 志 2015 年 11 月 第 7 卷 第 6 期 J Mol Diagn Ther， November 2015， Vol． 7 No． 6
1．1 循环肿瘤细胞 CTCs 的 概 念 雏 形 最 早 于 1869 年 由 Ashworth
提出［3］。 当时 Ashworth 设 想，血液循环 中可能存 在 与原发病灶性质相同的肿瘤细胞，而这正是患者 体内肿瘤的播散机制。 越来越多的研究证实肿瘤 患者的外周循环中存在以小簇、团状形式存在的 肿 瘤 细 胞 ， 现 在 认 为 CTCs 是 恶 性 肿 瘤 出 现 血 路 转移的主要生物学基础，其数量的多少与患者的 预 后 关 系 密 切 ［4］。 早 期 关 于 CTCs 的 研 究 主 要 集 中 于 乳 腺 癌 ，30％ ～40％ 左 右 的 乳 腺 癌 患 者 的 外 周 血 或 骨 髓 中 可 以 检 测 到 CTCs， 尤 其 在 缺 乏 明 确淋巴结及远处器官转移、 临床分期早期患者的 体内就存在， 是预测患者未来发生转移的独立预 后因素［5］。 随 着肿瘤特异 性标记物应 用的广泛开 展 和检测敏感 性的提高， 在 许多恶 性 肿 瘤 如 肺 癌 ［6］、 胰 腺 癌 ［7］、前 列 腺 癌 ［8］、膀 胱 癌 ［9］、大 肠 癌 ［10］等 中 均 能 发 现 CTCs，而 且 检 出 率 也 要 远 远 高 于 上 述 的 比 例 ，甚 至 还 有 学 者 将 CTCs 形 容 为 实 体 瘤 的 “白 血 病 样 ”阶 段 （leukemic phase）［11］。 肿 瘤 进 展 过 程 中 ， 肿瘤细胞通过基因突变或表观遗传学改变等而获 得了更具侵袭能力的生物表型或干细胞特性，其 中 上 皮－间 叶 转 化 （epithelial to mesenchymal transition， EMT） 被 认 为 是 CTCs 出 现 的 主 要 机 制 之 一 ［12］。 由 此 看 来 ，CTCs 与 其 起 源 的 原 发 病 灶 中 的 肿瘤细胞虽然相似， 但是两者之间并不存在完 全相同基因谱或表达谱系。 大量的临床试验均 证 实 ，CTCs 具 有 很 强 的 预 后 判 断 和 转 移 预 测 价 值 ［13］， 因 此 通 过 研 究 CTCs 的 生 物 学 和 遗 传 学 特 性相较于原发灶具有更丰富的临床指导意义。 1．2 循环肿瘤 DNA
可以来自外周血或骨髓中存在的微转移癌栓或 CTCs 。 ［18］ 肿瘤细胞产 生 ctDNA 主要通 过被动和主 动机制 2 种途径来完成。 被动机制是指凋亡和坏 死 的 细 胞 会 释 放 出 细 胞 核 和 线 粒 体 DNA 进 入 血 液 循 环 。 ［19］ 在 正 常 生 理 情 况 下 ，释 放 的 DNA 数 量 不多， 单核巨噬细胞能及时清除坏死和凋亡细胞 的碎片，因 此正 常 人 群 外 周 血 中 的 游 离 DNA 含 量 几乎测不出来。 而肿瘤患者体内由于肿瘤细胞生 长快速， 坏死和凋亡的细胞数目明显增加， 释放 的 DNA 数 量 也 多 ，再 加 上 肿 瘤 免 疫 功 能 的 紊 乱 ， 不 能 及 时 清 除 ，因 而 造 成 较 多 的 ctDNA 进 入 外 周 血 循 环 ［20］。 主 动 机 制 则 是 指 肿 瘤 细 胞 能 主 动 释 放 DNA 到 外 周 循 环 之 中 。 研 究 发 现 ，在 前 列 腺 癌 ［18］、 肺 癌 、 ［21］ 乳 腺 癌 、 ［22］ 大 肠 癌 、 ［23］ 肝 癌 、 ［24］ 膀 胱 癌 、 ［25］ 宫 颈 癌 、 ［26］ 胰 腺 癌 、 ［27］ 卵 巢 癌 等 ［28］ 人 类 恶 性 肿 瘤 中 均 能 检 测 到 ctDNA。 外 周 血 中 提 取 得 到 的 ctDNA 包含了编码和非编码 DNA， 可以用于肿 瘤相关基 因的遗传学和表观遗传学研究，如基因突变、异常 扩 增 、 杂 合 性 缺 失 （loss of heterozygosity， LOH）、 微 卫 星 不 稳 定 性 （microsatellite instability， MSI）、 特 异 性 靶 点 标 记 、表 达 谱 分 析 、miRNA 研 究 、染 色 体分析以及甲基化等，用于指导临床用药、判断预 后、化疗效果评估、耐药性检测、监测病程进展以 及复发转移的预测等方面。
［关键词］ 液态活检； 非侵入式检测； 分子检测
Recent advances of liquid biopsy and its application in medical oncology CHEN Ying, ZHU Minghua★ (Department of Pathology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, China, 200433)
目前发现肿瘤患者的外周血中也能检测到游 离 核 酸 （cell-free nuclear acids， cfNAs） 的 存 在 ， ［17］ 认为是由肿瘤细胞产生的， 其中以基因组和线粒 体 DNA 成分为 主，也被称 为循环肿 瘤 DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）， 其他还包括 RNA 和 microRNA 。 肿 瘤 细 胞 可 以 是 来 自 组 织 中 的 病 灶 ， 也
[KEY WORDS] Liquid biopsy; Non-invasive analysis; Molecular test
Baidu Nhomakorabea
组织病理学是在显微镜下直接观察病变组织 的形态学改变，因而病理诊断被誉为是疾病诊断的 “金标准”， 在 临床诊断中 具有不可 动摇的地 位 ［1］。 随着分子生物学研究日益发展， 人类对疾病的认 识也不再局限于表型和形态学， 根据肿瘤发生的 分子机制，形成了分子病理学。 分子病理学的研究 对象十分广泛，包含了组织、细胞和体液，而“液态 活检”（liquid biopsy）就是其中的重要分支之一。
分 子 诊 断 与 治 疗 杂 志 2015 年 11 月 第 7 卷 第 6 期 J Mol Diagn Ther， November 2015， Vol． 7 No． 6 · 363 ·
mL外 周 血 表 明 患 者 预 后 较 好 。 根 据 CTCs 的 含 量 与临床预后的关联其他还在研究阶段的磁珠包 被标记物如广谱标记物（全角蛋白）和其他肿瘤 类 型 相 关 标 记 物 如 CerBb2、Mucin、AFP 等 。 此 外 ， 用 于 分 离 CTCs 的 标 记 物 除 了 蛋 白 质 类 标 记 物 ， 还 包 括 了 mRNA 和 端 粒 酶 类 的 标 记 物 ［29］， 提 高 了 CTCs 的 检 出 效 率 。 但 是 肿 瘤 相 关 的 标 记 物 的种类非常繁杂， 并没有一个标记物能 “放之四 海而皆准”。 基于这些情况产生了阴性富集法。 所 谓阴性富集法是指磁珠结合得到的细胞不是所需 要的细胞， 主要应用了针对白细胞的广谱标记物 CD45，在 磁 场 作 用 中 剔 除 了 有 核 细 胞 游 中 的 白 细 胞 ， 其 中 未 被 结 合 的 细 胞 就 是 所 需 要 的 CTCs ［30］， 能 大 大 增 加 CTCs 的 检 出 数 量 。 但 是 免 疫 磁 珠 法 仍然受到标记物的限制， 由于肿瘤细胞与正常细 胞存在交叉抗原表达， 并且肿瘤细胞本身存在显 著 异 质 性 ， 同 一 个 患 者 得 到 的 CTCs 并 不 会 表 达 一致性的标记， 因此容易出现假阳性或假阴性的 结果。 2．1．2 CTCs 芯片技术
2 常用检测技术
2．1 CTCs 分离、富集相关技术 2．1．1 免 疫 磁 珠 富 集 法 （immunomagnetic beads separation， IMS）
IMS 技 术 基 于 细 胞 表 面 的 抗 原 与 连 有 特 异 性 抗体的磁珠相结合， 并在外源磁场的作用下富集 细胞， 其根据分离的策略可以分为阳性富集法和 阴性富集法两大类。 阳性富集法是指磁珠结合得 到的细胞就是所需要的细胞。 目前唯一已获得美 国食品药品 监 督 局 （Food and Drug Administration， FDA）批 准 上 市 的 CELLSEARCH誖循 环 肿 瘤 细 胞 检测试剂盒就是针对细胞表面的上皮细胞粘附分 子 （epithelial cell adhesion molecule， EpCAM） 来 分 离 CTCs。 该试剂盒提出了具有临床预后判断意义 的 CTCs 的检出数目： 转移性乳 腺癌和前列 腺中， CTCs 数目小 于 5 个 ／ 7．5 mL 外周血 表明患者 预 后 较 好 ； 转 移 性 大 肠 癌 中 ，CTCs 数 目 小 于 3 个 ／ 7．5
“液 态 活 检 ” 这 一 概 念 最 早 在 1974 年 由 Sorrells 等［2］提 出，当时 指 关 节 腔 的 滑 液 分 析 用 于 诊 断 滑膜疾病。 液态活检的标本来源主要为以血液为
主的体液，其中包括胸水、腹水等其他体液成分， 而血液是最容易获得的临床标本。 本文详细总结 了液态活检的对象、方法和应用领域，旨在为肿瘤 的诊断和治疗提供新的手段， 为病人的预后和转 归提供新的依据。
1 液态活检的研究对象
液态活检的研究对象主要包括外周血循环中 存 在 的 循 环 肿 瘤 细 胞 （circulating tumor cells， CTCs） 和 游 离 DNA （cell -free DNA，cfDNA） 两 大 类。
基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 （81172310） 作 者 单 位 ：第 二 军 医 大 学 附 属 长 海 医 院 病 理 科 ，上 海 200433 ★通 讯 作 者 ：朱 明 华 ， E-mail：mhzhu2000＠hotmail．com
分 子 诊 断 与 治 疗 杂 志 2015 年 11 月 第 7 卷 第 6 期 J Mol Diagn Ther， November 2015， Vol． 7 No． 6 · 361 ·
誗述 评誗
液态活检技术的发展及肿瘤领域的应用
陈颖 朱明华★
［摘 要］ 广义而言，液态活检是指以血液为主的体液标本中细胞及核酸的检测，包括了循环肿瘤 细 胞 和 游 离 DNA 两 大 类 。 液 态 活 检 属 于 新 型 的 无 创 性 分 子 病 理 检 测 方 式 ，具 有 广 阔 的 临 床 应 用 前 景 ；对 于传统病理学而言，液态活检的出现既是机遇也是挑战。 本文主要从分子检测技术以及临床应用价值这 两方面综合阐述了液态活检作为一种新的非侵入式的检测方法在临床肿瘤早期诊断、筛查等领域的发展 前景及面临的挑战。
[ABSTRACT] Liquid biopsy refers to the analyses of circulating tumor cells or cell-free fragments of DNA that mainly exist in the bloodstream and other body fluid. Liquid biopsy is a novel kind of non -invasive technique and has a wide prospect of clinical application in the molecular pathological field. The occurrence of liquid biopsy is both an opportunity and challenge towards traditional histopathology. In this paper, the advances in the emerging new techniques of liquid biopsy and its clinical application values in the field of cancer care, including prognosis assessment, early cancer screening and prediction of treatment responses will be reviewed.
· 362 · 分 子 诊 断 与 治 疗 杂 志 2015 年 11 月 第 7 卷 第 6 期 J Mol Diagn Ther， November 2015， Vol． 7 No． 6
1．1 循环肿瘤细胞 CTCs 的 概 念 雏 形 最 早 于 1869 年 由 Ashworth
提出［3］。 当时 Ashworth 设 想，血液循环 中可能存 在 与原发病灶性质相同的肿瘤细胞，而这正是患者 体内肿瘤的播散机制。 越来越多的研究证实肿瘤 患者的外周循环中存在以小簇、团状形式存在的 肿 瘤 细 胞 ， 现 在 认 为 CTCs 是 恶 性 肿 瘤 出 现 血 路 转移的主要生物学基础，其数量的多少与患者的 预 后 关 系 密 切 ［4］。 早 期 关 于 CTCs 的 研 究 主 要 集 中 于 乳 腺 癌 ，30％ ～40％ 左 右 的 乳 腺 癌 患 者 的 外 周 血 或 骨 髓 中 可 以 检 测 到 CTCs， 尤 其 在 缺 乏 明 确淋巴结及远处器官转移、 临床分期早期患者的 体内就存在， 是预测患者未来发生转移的独立预 后因素［5］。 随 着肿瘤特异 性标记物应 用的广泛开 展 和检测敏感 性的提高， 在 许多恶 性 肿 瘤 如 肺 癌 ［6］、 胰 腺 癌 ［7］、前 列 腺 癌 ［8］、膀 胱 癌 ［9］、大 肠 癌 ［10］等 中 均 能 发 现 CTCs，而 且 检 出 率 也 要 远 远 高 于 上 述 的 比 例 ，甚 至 还 有 学 者 将 CTCs 形 容 为 实 体 瘤 的 “白 血 病 样 ”阶 段 （leukemic phase）［11］。 肿 瘤 进 展 过 程 中 ， 肿瘤细胞通过基因突变或表观遗传学改变等而获 得了更具侵袭能力的生物表型或干细胞特性，其 中 上 皮－间 叶 转 化 （epithelial to mesenchymal transition， EMT） 被 认 为 是 CTCs 出 现 的 主 要 机 制 之 一 ［12］。 由 此 看 来 ，CTCs 与 其 起 源 的 原 发 病 灶 中 的 肿瘤细胞虽然相似， 但是两者之间并不存在完 全相同基因谱或表达谱系。 大量的临床试验均 证 实 ，CTCs 具 有 很 强 的 预 后 判 断 和 转 移 预 测 价 值 ［13］， 因 此 通 过 研 究 CTCs 的 生 物 学 和 遗 传 学 特 性相较于原发灶具有更丰富的临床指导意义。 1．2 循环肿瘤 DNA
可以来自外周血或骨髓中存在的微转移癌栓或 CTCs 。 ［18］ 肿瘤细胞产 生 ctDNA 主要通 过被动和主 动机制 2 种途径来完成。 被动机制是指凋亡和坏 死 的 细 胞 会 释 放 出 细 胞 核 和 线 粒 体 DNA 进 入 血 液 循 环 。 ［19］ 在 正 常 生 理 情 况 下 ，释 放 的 DNA 数 量 不多， 单核巨噬细胞能及时清除坏死和凋亡细胞 的碎片，因 此正 常 人 群 外 周 血 中 的 游 离 DNA 含 量 几乎测不出来。 而肿瘤患者体内由于肿瘤细胞生 长快速， 坏死和凋亡的细胞数目明显增加， 释放 的 DNA 数 量 也 多 ，再 加 上 肿 瘤 免 疫 功 能 的 紊 乱 ， 不 能 及 时 清 除 ，因 而 造 成 较 多 的 ctDNA 进 入 外 周 血 循 环 ［20］。 主 动 机 制 则 是 指 肿 瘤 细 胞 能 主 动 释 放 DNA 到 外 周 循 环 之 中 。 研 究 发 现 ，在 前 列 腺 癌 ［18］、 肺 癌 、 ［21］ 乳 腺 癌 、 ［22］ 大 肠 癌 、 ［23］ 肝 癌 、 ［24］ 膀 胱 癌 、 ［25］ 宫 颈 癌 、 ［26］ 胰 腺 癌 、 ［27］ 卵 巢 癌 等 ［28］ 人 类 恶 性 肿 瘤 中 均 能 检 测 到 ctDNA。 外 周 血 中 提 取 得 到 的 ctDNA 包含了编码和非编码 DNA， 可以用于肿 瘤相关基 因的遗传学和表观遗传学研究，如基因突变、异常 扩 增 、 杂 合 性 缺 失 （loss of heterozygosity， LOH）、 微 卫 星 不 稳 定 性 （microsatellite instability， MSI）、 特 异 性 靶 点 标 记 、表 达 谱 分 析 、miRNA 研 究 、染 色 体分析以及甲基化等，用于指导临床用药、判断预 后、化疗效果评估、耐药性检测、监测病程进展以 及复发转移的预测等方面。
［关键词］ 液态活检； 非侵入式检测； 分子检测
Recent advances of liquid biopsy and its application in medical oncology CHEN Ying, ZHU Minghua★ (Department of Pathology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, China, 200433)
目前发现肿瘤患者的外周血中也能检测到游 离 核 酸 （cell-free nuclear acids， cfNAs） 的 存 在 ， ［17］ 认为是由肿瘤细胞产生的， 其中以基因组和线粒 体 DNA 成分为 主，也被称 为循环肿 瘤 DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）， 其他还包括 RNA 和 microRNA 。 肿 瘤 细 胞 可 以 是 来 自 组 织 中 的 病 灶 ， 也
[KEY WORDS] Liquid biopsy; Non-invasive analysis; Molecular test
Baidu Nhomakorabea
组织病理学是在显微镜下直接观察病变组织 的形态学改变，因而病理诊断被誉为是疾病诊断的 “金标准”， 在 临床诊断中 具有不可 动摇的地 位 ［1］。 随着分子生物学研究日益发展， 人类对疾病的认 识也不再局限于表型和形态学， 根据肿瘤发生的 分子机制，形成了分子病理学。 分子病理学的研究 对象十分广泛，包含了组织、细胞和体液，而“液态 活检”（liquid biopsy）就是其中的重要分支之一。