园艺植物生物技术第二章 园艺植物脱毒

枣树病毒病：示病树干部皮层扭曲
示皮层内的黑褐色“木刺”
甜菜黄化病毒 大葱萎缩病毒
三、园艺植物病毒病的传播途径及防治
传播途径： 介体传播：昆虫，线虫，螨虫 接触传播：汁液，人为，嫁接 防治： 栽培无病毒苗木； 加强检疫； 防治传毒虫媒； 抗病毒基因工程。
四、园艺植物脱毒技术
脱毒的意义
应用植物脱毒技术培育无病毒苗可以使品 种复壮，增强适应能力和抗逆能力，明显提高 作物的产量和品质。
园艺植物病毒病的严重性
据不完全统计，草莓能感染62种病毒和类菌质体。核 果类病毒达90多种。马铃薯病毒达30余种，苹果也 有30多种病毒侵染，柑桔有20多种病毒，观赏植物 的病毒病达100多种。
症状表现: 在田间，病株较健株生长矮小且衰弱，叶色淡。病株嫁接口 周围肿大。木质部表面产生深褐色凹陷裂沟。
1977年，Quak：分生组织中高浓度的生长素和细胞分裂素阻滞了病 毒的侵入或抑制了病毒活性。

酶缺乏
1969年Stace－Smith认为病毒合成可能需要酶的参与。
抑制因子
1976年Martin－Tanguy认为分生组织中自然存在某种抑制因子。
茎尖脱毒培养繁育程序
通常茎尖培养脱毒效果的好坏与茎尖大小呈负 相关，而培养茎尖成活率的高低则与茎尖的大 小呈正相关。
病毒在植物体内分布不均匀的机理目前还不十分清楚，但根 据病毒及分生组织的特性，学者们提出了一些假说，主要有 以下几种： 能量竞争
病毒核酸和植物细胞分裂时，DNA合成均需要消耗大量的能量。

传导抑制
1966年Quak：病毒传播主要是通过微管束，但分生组织中胞间连丝 和微管组织还不健全。

激素抑制
抗原吸附
常用血清学鉴定方法 （1）免疫电镜技术 （2）酶联免疫吸附分析 （3）直接组织免疫杂交分析
免疫修饰（加入抗体） 洗脱
反应（染色，酶促反应）
观察
电子显微镜鉴定法
现代电子显微镜 (electron microscope) 的分 辨能力可 达 0.5nm， 因此利用电子显微镜观 察， 比生物学鉴定更直观，而且速度更快。 对不表现可见症状的潜伏病毒来说，血清法 和电镜法则是惟一可行的鉴定方法 。 能否观察到病毒，还取决于病毒浓度的高低， 浓度低则不易观察到。
热处理的方法


热水浸泡 ： 是将剪下的接穗或种植材料， 在 50~55 ℃的热水中 浸泡数分钟或35 ℃温水处理30-40 h, 方法简便，但易 使材料受损伤， 到 55 ℃时则大多数植物会被杀死。 该方法适合甘蔗、木本植物和休眠芽。 高温空气 是将旺盛生长的植物在 35~40 ℃条件下生长发育， 处理时间的长短，因病毒种类不同可由数分钟到数周不 等，热处理之后要立即把茎尖切下来嫁接到无病的砧木 上或进行组培。 该方法对活跃生长的茎尖效果较好，既能消除病毒， 又能使寄生植物有较高的存活机会，目前热处理大多采 用这种方法 。
五 脱毒苗的鉴定及检测技术
脱毒效果的检测
1、形态检测法 脱毒苗叶色浓绿，均匀一致，长势好 2、指示植物法 指示植物法是利用病毒在其他植物上产生的枯斑和 某些病理症状，作为鉴别病毒及病毒种类的标准， 也叫枯斑或空斑测定法。 接种某种病毒后能快速表现特有症状的植物称为指 示植物（indicator plant），又称鉴别寄主。
一般切取 0.2~0.5mm，带一两个叶原基的茎尖 作为培养材料较好 。
2.微体嫁接脱毒（micrografting of shoot tip）

微体嫁接是组织培养与嫁接方法相结合来获得无 病毒苗木的一种新技术。它是将 极小 （0.1~0.2mm)的茎尖作为接穗 ，嫁接到由试管中 培养出来的无菌实生砧木上 ，继续进行试管培养 ， 愈合成为完整的植株 而达到脱毒的效果。

分子生物学检测法
核酸杂交技术（人工标记的病原互补 DNA，杂交，显影） PCR技术 双链核糖核酸分析

病毒复制时以单链RNA为模板合成双链RNA，一般 不易被降解。所以一旦植物感染病毒，体内就会存在 双链RNA。所以提取待检测样本的总RNA，将DNA和 单链RNA降解后，凝胶电泳分析样品中是否有双链 RNA
第二章 园艺植物 脱毒与离体快速 繁殖
第一节 园艺植物病毒病的危害
多数无性繁殖的园艺植物易受到病毒的侵染， 病毒侵染可经带毒的无性繁殖材料传至下一代， 并逐渐积累，导致植物种性退化，造成作物产量 下降或品质降低甚至死亡。 由病毒引起的植物病害称为植物病毒病 (Plant virus disease)
缺陷： 热处理只对那些球状的病毒 ( 如葡萄扇叶病毒、苹果花叶病毒 ) 或线状的病毒 ( 如马 转薯 X，Y 病毒、康乃馨病毒 ) 有效果，而 对杆状病毒 ( 如牛蒡斑驳病毒、千日红病毒 ) 不起作用。




香石竹在38－40℃条件下经两个月处理可除去 全部病毒。 菊花在 35℃－ 38℃的条件下处理 60d 可使病毒 失活。 马铃薯在 37℃条件下处理 10 － 20d 能除去卷叶 病毒。 柑橘黄化病毒 30℃－ 40℃条件下处理 7 － 12 周。
病毒是一种非细胞形态的专性寄生物，仅含
有一种核酸(RNA 或DNA）和蛋白质，必须 在活细胞中才能增殖 。 病毒粒体有杆状、线状、球状 3 种。 不同形态的病毒其大小也不同，计量单位 用纳米（nm）表示。
病毒是介于生命与非生命之间的一种物质形 式，因此我们说它是边缘生命。病毒存在于环 境之中，游离于细胞之外时，不能复制，只以 一种有机物的物质形式存在。但病毒进入细胞 之后，它可以控制细胞，使其听从病毒生命活 动需要，表现它的生命形式。因此，病毒是由 一个或几个核酸分子组成的基因组，有一层蛋 白或脂蛋白保护性外壳，且可在一定宿主细胞 中自我复制的感染性因子。 病毒的生命形式极其经济，因为基因组中的 每个核苷酸均有用。病毒最明显的特点是病毒 极其自私，复制原料和能量全部来自它所寄生 的细胞，并使细胞产生病变。在进化过程中， 它会与细胞和平共处，便于更好利用细胞的资 源，但是病毒引起的病害常常是突发性的。如 人类的肿瘤，往往是多年潜伏，一旦条件适合 或受到外界刺激利于病毒的增殖，病毒就会突 然致病。然而病毒可以被改造和利用，如基因 治疗的在基因工程中用做载体。
脱毒苗的保存与繁殖



原原种：脱毒试管苗出瓶移栽后的苗木被称作原 原种 (initail stocks)，一般多在科研单位的隔离 网室内保存 。脱毒原原种苗每年应进行一次病毒 检测，发现问题即淘汰。检测机构要将病毒检测 结果报告有关部门。 原种：脱毒原原种苗定植于无土壤线虫、无病源 和防虫隔离区内，分株繁殖的第一代植株为脱毒 原种苗 由脱毒原种苗定植于无土壤线虫、无病源和防虫 隔离区内，分株繁殖后代为脱毒生产用苗。
脱毒方法
1.茎尖培养脱毒 2.微体嫁接脱毒 3.热处理脱毒 4.热处理结合茎尖培养脱毒 5.抗病毒药剂脱毒
1.茎尖培养脱毒 又称为分生组织培养（meristem culture）



1934年，White发现TMV在烟草根中的分布是不均匀的， 越靠根尖区病毒含量越低，在根尖的顶端不含病毒。 1949年，Limasset和Cornuet茎尖分生组织叶不带病毒。 1952年，Morel和Martin首先利用茎尖分生组织培养获 得了大丽花和马铃薯无病毒苗，同时建立了茎尖脱毒的 组织培养技术体系。 2001年，Ayabe和Sumi报道利用大蒜茎片生长点培养脱 除病毒的方法。
2.微体嫁接脱毒（micrografting of shoot tip）


影响微体嫁接成活的因素主要是接穗的大小和取 样时间。一般春天从新梢上取材嫁接的成活率显 著高于其他季节取材的成活率。 微体嫁接技术难度较大，不易掌握 ，与实际应用 还有相当距离。但随着新技术的发展与完善， 微 体嫁接技术也会有很大发展。
一、植物病毒的概念与形态




早在 17 世纪初，郁金香等植物表现花叶、黄化、矮缩等症 状，当时人们把这些异常现象，都归诸于生理的或遗传的 原因 ，或其他毒素的作用。 1886 年，德国人Mayer发现，把烟草花叶病植株的汁液 , 接 种到无病烟草上，可以使健康植株发病，于是他断定烟草 花叶病是由细菌引起的。 1892 年，伊万诺夫斯基（俄国）发现，烟草花叶病的病原 物可以通过细菌不能通过的微孔漏斗，因此他认为烟草花 叶病的病原不是细菌，而是一种 “ 传染性活液 ” 。 1898 年，荷兰人 Beijerind 把这种 “ 传染性活液 ” 定名为 病毒（virus) 。其后又经过近 40 年，美国的 Stonley(1935) 把 烟草花叶病毒提纯，得到它的结晶体，证实病毒是一种含 有核酸的蛋白质，并逐步明确病毒是由一种核酸和蛋白质 衣壳组成 ，非细胞形态的分子生物。
SARS
HIV
二、园艺植物病毒病的危害特点
园艺植物的特点：种类和繁殖方式多样性 蔬菜：一年生为主，种子、块茎、鳞茎； 寄主复杂，媒体传播、种子传播 果树：一旦感染终生带毒；无性繁殖系数 决定了病毒传播速度；病毒侵染破坏正常 代谢，导致树体衰退； 表现：削弱生长势，降低产量、品质、价 值，严重者导致死亡。
4.热处理结合茎尖培养或微嫁接技术脱毒

将热处理与茎尖分生组织培养结合起来， 则可以取稍大的茎尖进行培养，这样能够 大大提高茎尖的成活率和脱毒率。
5.抗病毒药剂脱毒



在茎尖培养和原生质体培养中，在培养基内加 用抗病毒醚(ribavirin)，能抑制病毒复制。 山家弘士 (1986)发现抗病毒醚对苹果褪绿叶斑 病毒 (ACLSV) 和苹果茎沟病毒 (ASGV)，在 苹果植株体内都有抑制增殖效果。 目前用此法也不可 能脱除所有病毒，如果使 用不当，药害现象比较严重， 此种脱毒处理 还处于探索阶段。

症状表现: 病叶片上产生淡绿色或 浅黄色环斑，发生无规
律，有时病斑只发生在
主脉或侧脉的周围。高 度感病品种的病叶往往 变形或卷曲。病斑偶尔
也发生在果实上，但病
果不变形果肉组织也无 明显损伤。 有些品种无明显症状，或仅有淡绿色或黄绿色小斑点 组成的轻微斑纹。阳光充足的夏季症状明显，而且感 病品种的叶片上常出现坏死区域。多雨季节或阳光不 充足时，症状轻微。带毒梨树的干周生长量减少10%， 新稍生长量和叶面积减少20%，树势衰弱且易遭冻害。
花 生 矮 缩 病 毒
水 稻 矮 小 病 毒
番茄条斑型病毒病病果
大白菜病毒病又叫孤丁病、抽 疯病，苗期发病心叶呈明脉或 叶脉失绿，后产生浓淡不均的 绿色斑驳或花叶。成株期发病 早的，叶片严重皱缩，质硬而 脆，常生许多褐色小斑点，叶 背主脉上生褐色稍凹陷坏死条 状斑，植株明显矮化畸形，不 结球或结球松散。
3、热处理脱毒
发现：1889 年，印度尼西亚爪哇将患枯萎病的甘蔗
放在 50~52 ℃热水中30min，甘蔗就可去病生长良好 通过热处理（heat treatment），又称温热疗法 （thermotherapy），可由受侵染的个体得到无病毒 植株。 利用植物和病毒的耐热性不同，在高于正常温度的 环境条件下，植物组织中的很多病毒受热后可被部 分或全部钝化或失去活性，而寄主植物组织很少或 不会受到伤害；或在高温条件下，植物的生长加快， 病毒的增殖速度跟不上植物的生长速度而被抛在其 后，使植物的新生部分不带病毒。
2、接种方法 汁液摩擦接种法 嫁接法：小叶嫁接法 双重芽嫁接法 双重切接法 指示植物直接嫁接法

汁液摩擦接种法：从被鉴定植物上取1~3g幼
叶 →研碎→过滤→取滤液涂抹于指示植物的叶面
上（金刚砂）→保温15~25℃ →接种后2~6d 可
见症病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白(抗原 antigen)， 给动物注射后会产生一种相应的免疫 球蛋白，称为抗体（antibody） 抗体是动物在外来抗原的剌激下产生的一种免疫 球蛋白，抗体主要存在于血清中，故含有抗体的 血清即称为抗血清 (antiserum) 。 这种抗原和抗体所引起的凝集或沉淀反应就叫做 血清反应。 因此，利用已知的抗体与未知的抗原能否特异结 合形成抗原-抗体复合物（血清学反应）的情况可 以判断病毒的有无。