卵黄抗体生产及应用技术.ppt
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5.普洛玛格公司的卵黄抗体纯化系统（Promega's EGGstract IgY）提供了快速和简易的IgY分离方法。 该系统能在约1小时内提取2～5mg/ml纯度75%的IgY。
续（2）
6.提纯方法的选择取决于IgY产量、纯度、费用要求和技 术水平。
7.常用ELISA测定IgY活性。 8.提纯后抗体冷冻或冻干保存。50%（w/v）蔗糖能在热、
4.USDA和FDA认为卵黄抗体是GRAS（generally regarded as safe） 且已允许商业生产用于人；
续（1）
5.符合动物福利原则。 因此，IgY具有可规模生产、成本低、特异性抗体
含量高、安全性好等优点,比实验室条件下通过实验动 物制备有限的高免血清更有实用性。
（五）IgY纯化、活性测定及保存
续（2）
5.影响IgY产量的因素包括： （1）抗原的质与量（颗粒/可溶性抗原、类毒素/菌体抗原、活菌/死菌，
免疫麻痹；高免疫原性和安全）
（2）机体方面，A包括产蛋鸡品种（来航鸡、洛岛红鸡及其杂交后代
的特异性IgY最高平均浓度有显著差异（D Carlander,2002)、B产蛋率和产蛋 间歇与IgY浓度、C蛋重及卵黄重、D营养影响免疫系统发育、免疫 机能状况和生产性能、E健康状况（SPF鸡群，起码应无免疫抑制 性疾病和垂直传播性疾病，对父母代IBD的免疫）
2.免疫反应具有交叉性，血缘越近，交叉反应程度越高；由于结构 上差异，IgY 与IgG几乎没有交叉免疫反应，减少了非特异结合和 假阳性；减少非特异性结合使免疫学检测灵敏性提高（达50%）；
3. IgY具有较强的抗热、抗酸、抗离子强度和一定的抗酶分解能力 （相对于IgG），提纯后IgY在合适条件储存10年滴度没有损失 （Olovson等，1993），幼畜可以口服，经保护处理后成年动物也 可以口服，提纯后可以肌注（孙希琪，1995） ；
1.鸡蛋储存在+4℃条件下6个月IgY活性损失很小。用做 食品和饲料添加剂，或兽医临床上，IgY多以全卵黄或 其水溶液的形式直接利用，或制成干粉利用。
2.用于诊断分析或纯化生物活性分子，或在人医临床上 则需要提高IgY纯度或提纯特异性IgY。 IgY纯化分三步：
第一步是粗提，将含有IgY的水溶性蛋白与水不溶的脂类和脂蛋白 分离，即除去脂质；方法有超滤、有机溶剂萃取、以及PEG、SDS 沉淀脂蛋白等，经粗提的上清液或水溶液中IgY含量占蛋白质的 15%； 第二步用硫酸葡聚糖钠等进一步沉淀，提纯出纯度大于80%的IgY， 此时的IgY要低温或冻干保存；
续（1）
第三步是精提法：使用凝胶渗透层析、阴离子交换层析或超滤方法 进一步纯化，获得纯度96%～99%的IgY。
3.Akita等建立的水稀释法：先在微酸条件下用水稀释卵 黄，分离出卵黄蛋白；再用盐析、超滤、乙醇沉淀、 凝胶过滤等进一步纯化IgY。
4.特异性抗体采用亲合色谱法纯化，离子交换层析法浓 缩；或用免疫亲合法直接从水溶液中提取。
（三）IgY结构特点
1.分子量160～180kDa，稍大于IgG（ 160kDa ）； 2.多一稳定区而少一铰链区（铰链区有较多脯氨酸，具
有韧性，与抗体分子构型变化有关）；
续（1）
这种差异没有影响IgY的抗原-抗体结合特性和结 合能力，结合价也是2（Warr等, 1995），然而对于pH、 温度及蛋白水解等引起构象变化的环境条件，IgY比 IgG稳定；
（3）免疫途径、免疫程序、佐剂
续（3）
6.生产卵黄抗体典型的免疫程序（Li-Chan等，2000）： (1)首免，胸肌注射0.5～1mg/羽弗氏完全佐剂等体积乳
化抗原； (2)首免后第3、5、7和25周用弗氏不完全佐剂乳化抗原
进行2～4次加强免疫，剂量逐步放大1～2倍。这种多 次注射加强剂量的抗原使之产生较高自动获得性免疫 的过程，称之为“超免疫作用”。
源抗体选择性分泌到卵黄内；
4.卵黄中Ig主要是IgG，叫IgY（IgM和IgA转移到蛋清中）； 5.小鸡通过IgY实现获得性被动免疫(猪、牛、马属通过初乳；兔
通过胎盘)； 6.卵黄中含有多种不同抗体（约200种，滴度取决于暴露程度；
M.Coleman,2000)； 7.用某种病原菌免疫母鸡，可产生特异性IgY， Sugita
由于缺乏铰链区，两个抗原结合片段（Fab）紧密 排列，使IgY缺少韧性及功能种类，在确定条件下沉淀 及聚合反应能力降低（Warr等，1995），这使其具有 抵抗幼龄动物胃酸屏障的能力。 3.IgY能介导过敏反应，与哺乳动物的IgE相似。
（四） IgY相对IgG的优势
1.高度保守的哺乳动物蛋白质对禽有较强的免疫原性，且产生有效 免疫反应所需抗原量小（Danielpour.D,1993），如IGF-1，且免 疫应答快；
等（1996）用26种甲醛灭活病原菌免疫产蛋鸡，IgY 可预防多种疾病。
(二) IgY转移时间、产量及影响产量的因 素
1.用HI、ELISA、ID检查卵黄中IgY，抗体应答形成时间 晚于血清1～2周（Theresa H P,1985；鸭腺病毒），以后与 血清测得的HI滴度一致，也有报道卵黄卵黄抗体具有 累积作用； 2.经加强免疫，卵黄中特异性IgY效价能维持数月奶至1 年； 3.一个卵黄约含100～400 mgIgY，一只产蛋鸡每年可获 得40～50gIgY（D .Carlander,2002），相当与30只家兔同期 内血清IgG 产量； 4.卵黄中抗原特异性抗体数量占IgY平均10%，范围是5% （抗胰岛素抗体）～28%（抗鼠IgG抗体），取决于免疫个体、免 疫程序及抗原的免疫原性；
卵黄抗体生产及应用技术进展
李建涛 2003年6月
内容
一、生产技术 二、应用技术 三、问题及展望
一、 生产技术wenku.baidu.com
(一) IgY产生过程 (二) IgY转移时间、产量及影响产量的因素 (三）IgY结构特点 (四) IgY相对与IgG的优势 (五) IgY纯化、活性测定及保存
(一) IgY产生过程
1.腔上囊是禽类特有的控制体液免疫的淋巴器官； 2.腔上囊中B细胞受到抗原刺激后分化成浆细胞，后者 分泌抗体进入血液； 3.通过血液循环和输卵管上皮层分泌滤泡，产蛋鸡将母
续（2）
6.提纯方法的选择取决于IgY产量、纯度、费用要求和技 术水平。
7.常用ELISA测定IgY活性。 8.提纯后抗体冷冻或冻干保存。50%（w/v）蔗糖能在热、
4.USDA和FDA认为卵黄抗体是GRAS（generally regarded as safe） 且已允许商业生产用于人；
续（1）
5.符合动物福利原则。 因此，IgY具有可规模生产、成本低、特异性抗体
含量高、安全性好等优点,比实验室条件下通过实验动 物制备有限的高免血清更有实用性。
（五）IgY纯化、活性测定及保存
续（2）
5.影响IgY产量的因素包括： （1）抗原的质与量（颗粒/可溶性抗原、类毒素/菌体抗原、活菌/死菌，
免疫麻痹；高免疫原性和安全）
（2）机体方面，A包括产蛋鸡品种（来航鸡、洛岛红鸡及其杂交后代
的特异性IgY最高平均浓度有显著差异（D Carlander,2002)、B产蛋率和产蛋 间歇与IgY浓度、C蛋重及卵黄重、D营养影响免疫系统发育、免疫 机能状况和生产性能、E健康状况（SPF鸡群，起码应无免疫抑制 性疾病和垂直传播性疾病，对父母代IBD的免疫）
2.免疫反应具有交叉性，血缘越近，交叉反应程度越高；由于结构 上差异，IgY 与IgG几乎没有交叉免疫反应，减少了非特异结合和 假阳性；减少非特异性结合使免疫学检测灵敏性提高（达50%）；
3. IgY具有较强的抗热、抗酸、抗离子强度和一定的抗酶分解能力 （相对于IgG），提纯后IgY在合适条件储存10年滴度没有损失 （Olovson等，1993），幼畜可以口服，经保护处理后成年动物也 可以口服，提纯后可以肌注（孙希琪，1995） ；
1.鸡蛋储存在+4℃条件下6个月IgY活性损失很小。用做 食品和饲料添加剂，或兽医临床上，IgY多以全卵黄或 其水溶液的形式直接利用，或制成干粉利用。
2.用于诊断分析或纯化生物活性分子，或在人医临床上 则需要提高IgY纯度或提纯特异性IgY。 IgY纯化分三步：
第一步是粗提，将含有IgY的水溶性蛋白与水不溶的脂类和脂蛋白 分离，即除去脂质；方法有超滤、有机溶剂萃取、以及PEG、SDS 沉淀脂蛋白等，经粗提的上清液或水溶液中IgY含量占蛋白质的 15%； 第二步用硫酸葡聚糖钠等进一步沉淀，提纯出纯度大于80%的IgY， 此时的IgY要低温或冻干保存；
续（1）
第三步是精提法：使用凝胶渗透层析、阴离子交换层析或超滤方法 进一步纯化，获得纯度96%～99%的IgY。
3.Akita等建立的水稀释法：先在微酸条件下用水稀释卵 黄，分离出卵黄蛋白；再用盐析、超滤、乙醇沉淀、 凝胶过滤等进一步纯化IgY。
4.特异性抗体采用亲合色谱法纯化，离子交换层析法浓 缩；或用免疫亲合法直接从水溶液中提取。
（三）IgY结构特点
1.分子量160～180kDa，稍大于IgG（ 160kDa ）； 2.多一稳定区而少一铰链区（铰链区有较多脯氨酸，具
有韧性，与抗体分子构型变化有关）；
续（1）
这种差异没有影响IgY的抗原-抗体结合特性和结 合能力，结合价也是2（Warr等, 1995），然而对于pH、 温度及蛋白水解等引起构象变化的环境条件，IgY比 IgG稳定；
（3）免疫途径、免疫程序、佐剂
续（3）
6.生产卵黄抗体典型的免疫程序（Li-Chan等，2000）： (1)首免，胸肌注射0.5～1mg/羽弗氏完全佐剂等体积乳
化抗原； (2)首免后第3、5、7和25周用弗氏不完全佐剂乳化抗原
进行2～4次加强免疫，剂量逐步放大1～2倍。这种多 次注射加强剂量的抗原使之产生较高自动获得性免疫 的过程，称之为“超免疫作用”。
源抗体选择性分泌到卵黄内；
4.卵黄中Ig主要是IgG，叫IgY（IgM和IgA转移到蛋清中）； 5.小鸡通过IgY实现获得性被动免疫(猪、牛、马属通过初乳；兔
通过胎盘)； 6.卵黄中含有多种不同抗体（约200种，滴度取决于暴露程度；
M.Coleman,2000)； 7.用某种病原菌免疫母鸡，可产生特异性IgY， Sugita
由于缺乏铰链区，两个抗原结合片段（Fab）紧密 排列，使IgY缺少韧性及功能种类，在确定条件下沉淀 及聚合反应能力降低（Warr等，1995），这使其具有 抵抗幼龄动物胃酸屏障的能力。 3.IgY能介导过敏反应，与哺乳动物的IgE相似。
（四） IgY相对IgG的优势
1.高度保守的哺乳动物蛋白质对禽有较强的免疫原性，且产生有效 免疫反应所需抗原量小（Danielpour.D,1993），如IGF-1，且免 疫应答快；
等（1996）用26种甲醛灭活病原菌免疫产蛋鸡，IgY 可预防多种疾病。
(二) IgY转移时间、产量及影响产量的因 素
1.用HI、ELISA、ID检查卵黄中IgY，抗体应答形成时间 晚于血清1～2周（Theresa H P,1985；鸭腺病毒），以后与 血清测得的HI滴度一致，也有报道卵黄卵黄抗体具有 累积作用； 2.经加强免疫，卵黄中特异性IgY效价能维持数月奶至1 年； 3.一个卵黄约含100～400 mgIgY，一只产蛋鸡每年可获 得40～50gIgY（D .Carlander,2002），相当与30只家兔同期 内血清IgG 产量； 4.卵黄中抗原特异性抗体数量占IgY平均10%，范围是5% （抗胰岛素抗体）～28%（抗鼠IgG抗体），取决于免疫个体、免 疫程序及抗原的免疫原性；
卵黄抗体生产及应用技术进展
李建涛 2003年6月
内容
一、生产技术 二、应用技术 三、问题及展望
一、 生产技术wenku.baidu.com
(一) IgY产生过程 (二) IgY转移时间、产量及影响产量的因素 (三）IgY结构特点 (四) IgY相对与IgG的优势 (五) IgY纯化、活性测定及保存
(一) IgY产生过程
1.腔上囊是禽类特有的控制体液免疫的淋巴器官； 2.腔上囊中B细胞受到抗原刺激后分化成浆细胞，后者 分泌抗体进入血液； 3.通过血液循环和输卵管上皮层分泌滤泡，产蛋鸡将母