表面等离子共振 (SPR) 技术与Biacore原理

SPR光学组件
微流控系统(IFC) 集成化、自动化的微流路控制系统 样品消耗量低 为互相作用分析而设计优化
微流控系统 (IFC)–流动池 IFC上有4个流动池 可选择单独、配对、串联使用。 流动池为配对使用进行了优化(Fc1-Fc2, Fc3-Fc4)
传感芯片
传感芯片
葡聚糖表面 亲水性 温和型: 和2%浓度的葡聚糖水溶液环境相 似 非特异性结合量低 高结合容量 易于进行共价结合 出色的化学稳定性
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表面等离子共振 (SPR) 技术与 Biacore原理
戴璐
表面等离子共振 (SPR)原理
表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR) 消逝波：当光从光密介质射入光疏介质，入射角增大 到某一角度，使折射角达到90°时，折射光将完全消 失，而只剩下反射光，这种现象叫做全反射。 当以波动光学的角度 来研究全反射时，人们发现当入 射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过 光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波 长再返回光密介质。则透过光疏介质的波被称为消逝 波。
30余种不同的试剂盒及缓冲液产品 ： 氨基偶联试剂盒、巯基偶联试剂盒； GST捕获试剂盒 GST重组蛋白 分析； NTA捕获试芯片
Biacore实验的基本流程
分析物和配体的定义
固定配体 (Immobilization)：
样品进样 (Injection)
表面等离子共振 (SPR)原理
等离子波：把金属表面的价电子看成是均匀正电荷背景下 运动的电子气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等，这 实际上也是一种等离子体。当金属受电磁干扰时，金属内 部的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力的存在，会 将部分电子吸引到正电荷过剩的区域，被吸引的电子由于 获得动量，故不会在引力与斥力的平衡位置停下而向前运 动一段距离，之后电子间存在的斥力会迫使已经聚集起来 的电子再次离开该区域。由此会形成一种整个电子系统的 集体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡反复进行， 进而形成的震荡称等离子震荡，并以波的形式表现，称为 等离子波。
SPR生物传感器
SPR生物传感器的光源为偏振光(polarized light),传感芯片 (sensor chip) 表面镀有一层金膜 , 实验时 , 先将一种生物分 子 (ligand) 固定在金膜表面 , 然后将与之相互作用的分子 (analyte) 溶于溶液 ( 或混合液 ) 流过芯片表面。SPR 检测器 能跟踪溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过 程的变化, 不同角度的反射光的光强被记录后得到角度 -光 强曲线图,每条曲线的波谷即为该曲线的共振角 ,共振角对 应的角度为共振信号 (resonance signal), 时间与对应共振 信号的曲线即为SPR传感图(sensorgram)。
芯片再生 (Regeneration)
将自发解离后仍然结合于配体的分析物彻 底洗掉。 配体的结合活性必须保留 。
传感图 (The Sensorgram)
实验设计

选用CM5传感芯片→在金膜表面固定表达 纯化后的D结构域蛋白→流过含抗体的样品 →抗体与D结构域蛋白的结合将使金膜与溶 液界面的折射率上升,从而导致共振角发生 变化→检测蛋白与抗体的结合情况。
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Biacore提供的生物分子相互作用信息：
有无结合 (Yes or No) 结合的特异性和选择性 (Specificity) 两种分子的结合强度 --亲和力 (Affinity) 结合和解离的快慢和复合体的稳定性 --动力学 (Kinetics) 功能复合体形成的参与者、协同者和组装顺序 (Mechanism) 分子结合的温度与热力学特征 (Thermodynamics) 目标分子活性含量的检测 (Concentration)
传感芯片的选择
11种不同的芯片种类 CM5, CM4, CM3：芯片 蛋白、肽段、小分子等 CM7：小分子化合物研究 SA芯片：生物素标记的分子，如核酸、糖类等 Biotin CAP芯片：可逆性生物素捕获芯片 NTA芯片：His重组蛋白 L1 芯片：模拟脂质双分子层环境 HPA芯片：实现膜系统相关的互作分析 C1芯片：研究细胞、病毒等大颗粒分子 Au裸金芯片：客户定制表面（材料、高分子等）
SPR生物传感器
以免疫学分析为例,在金膜表面固定某种受体(如抗 体),然后流过含相应配体(如抗原)的样品,配体与受 体的结合将使金膜与溶液界面的折射率上升,从而 导致共振角发生变化。为了表述的方便,共振角(或 共振信号)可以用共振单位(resonance units,RU) 来表示。对大多数生物分子而言,1000RU大约等 于1mm2的面积上有1ng的质量变化，相当于溶液 中蛋白浓度为6mg/ml。SPR生物传感器通过检测 获得共振角的改变程度,便可以对配体浓度进行定 量。
SPR 生物传感技术的应用领域 生物大分子的相互作用： 肿瘤研究 免疫学和传染病 神经科学 生物制药 蛋白质组学
Biacore可研究的生物分子范围
蛋白质 DNA/RNA 脂类 /脂质体/ 生物膜 多糖 多肽 小分子 全细胞/病毒/微生物
可分析的对象
Biacore核心组件
表面等离子共振 (SPR)原理
SPR光学原理：光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象 时，会形成消逝波进入到光疏介质中，而在介质 中又存 在一定的等离子波。当两波相遇时可能会发生共振。当消 逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大 幅度地减弱。能量从光子转移到表面等离子，入射光的大 部分能量被表面等离子波吸收，使反射光的能量急剧减少。 可以从反射光强响应曲线看到一个最小的尖峰，此时对应 的入射光波长为共振波长，使反射光完全消失的入射角就 是SPR角。SPR角随金膜表面折射率变化而变化，而折射 率的变化又与金膜表面结合的分子质量成正比。因此可以 通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取分子之间相 互作用的特异信号。
分析物 (Analyte)进样后，以恒定的流速和 浓度流过芯片表面 样品中的待分析物与固定在芯片表面上的 配体发生结合，芯片表面物质的质量发生 改变，仪器记录下对应的响应值 (response) 的改变 进样结束后，切换缓冲液流过芯片表面， 分析物由配体上自发解离，解离的进程由 响应值实时监控。