基因工程菌培养

2、G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是G+菌，它没有外膜， 并且能把蛋白分泌（excretion）到胞外。它的这一性质对生产 非常有吸引力。 主要问题: •枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。 •枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差，所 以在使用上有较大的限制，
3、低等真核细胞
大肠杆菌 G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
1、大肠杆菌
如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最普遍选用的 宿主。
优点：
人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任 何生物深。有利于进行复杂的基因操作；
大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度 （50g/l）； 大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
EL-Mansi和Luli假设的乙酸抑制机理是：乙酸在中性pH环境 中以离子化（CH3COO－）和质子化（CH3COOH）两种形式 存在，质子化的乙酸具有弱的亲脂性可以穿过线粒体膜进入 胞内，在细胞内（pH7.5）解离成CH3COO-和H＋，这样就降 低了膜内的pH值，使膜内外的pH差减小，减弱了质子的推动 力，产生的能量就被大大减少，扰乱了细胞的正常代谢和生 理活性。
• 有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、磷酸化后才 有活性。
• 治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安全，降低成本 并不重要，由于这些产品大多用量很小，价格高，附加值高。
二、宿主-载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统，一般希望翻译后 的处理要简单，如果用于食品要考虑宿主菌是否列入FDA表中， 列入的认为是安全的菌。
四、生长与表达的影响因素
1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响
不同发酵条件下工程菌发酵结果
通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量
1 1 150 1.8 7.0 0.7 4
1.9 13.8%
2 2 250 2.6 7.8 0.77 4
2.08 16.7%
3 3 500 3.8 7.5 0.74 6
但在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细 胞，例如1000L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有 1015个细胞，那么在这个反应器中就含有109个无质粒细 胞。
质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响，如溶氧、温度、 培养基组成和恒化器中的稀释速率。许多质粒也会形成多 聚体，它是相同质粒附着在一起形成一个单位。
期后期，由于发酵液中营养的消耗，氧气的缺乏及代谢产物的
积累，使菌体的生长速度明显受到抑制。在此状态下诱导，表 达显然受到影响。
5、乙酸对生长和表达的影响
（1）乙酸的产生及抑制作用机理
当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳产生所需要量或在 缺氧的条件下便会产生大量的乙酸，特别是在培养时间较长的 高密度发酵过程中，问题更为严重。
0.015
6.0
酶表达水平 15.0%
0.049
19.1
31.1%
0.160
72.5
41.5%
0.225
102.6
49.8%
0.295
165.0
57.7%
0.360
105.5
53.4%
0.410
62.4
44.5%
0.450
30.2
22.5%
在A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌体进入诱导状态， 酶蛋白的积累加快，酶活和表达水平都较高。而菌体进入对数
基于以上的问题，人们发展了甲醇营养型酵母作为第 二代酵母表达系统。
（二）甲醇营养型酵母
甲醇营养型酵母主要包括Candida、Torulopsis、 Hansenula、Pichia。用作表达宿主株的主要是
Hansenula和Pichia。
重要特性 利用甲醇作为唯一的碳源和能量来源,因为甲醇能诱导其表达 甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶（Alcohol Oxidase,AOX） 二羟丙酮合成酶（Dihydroxy-acetone synthase,DHAS）和 过氧化氢酶（Catalase），表达的DHAS的含量甚至可达到 总细胞蛋白的60-80%。 而当以葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源时，AOX几乎不表达。 进一步研究表明，AOX的表达是转录水平调控的，其启动子 能非常有效地控制外源基因的表达。
(3) 宿主细胞突变
宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突变通 常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。
例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启 动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编 码蛋白的生产水平。
乳糖操纵子是常用是操纵子，通过加入乳糖或它的结构 类似物（如IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半 乳糖苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构 类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。
2.10 18.2%
4 3 500 4.0 7.0 0.83 6
2.27 26.4%
5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9%
*鲤鱼生长激素基因工程菌
在诱导表达期间，要维持外源基因的高水平转录和翻译，细胞 需要大量的能量代谢以促进呼吸作用，要增大通气量和提高搅 拌转速来保证较大的溶氧值。
控制基质浓度流加 恒pH流加 恒溶氧流加 控制比生长速率的葡萄糖流加
六、甲醇营养型酵母的生长和表达
（一）酵母作为宿主菌的优点 单细胞低等真核生物，易于培养、繁殖快、便于基因工程 操作 具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功能，具有适合于真 核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统 分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化。
关键点：高密度、高表达
菌密度的测定：光密度（OD值或A值）在 波长600～660
菌生长的障碍是 重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢 重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合成 后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水 性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会 导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌的比生长速率往往 远小于宿主菌。
降低培养温度
将温度从370C降低到26-300C可以降低菌体对营 养物的吸收率，从而减少有机酸的形成。
透析培养
在重组菌的培养过程中可以利用透析技术除去发酵液中有 害物质，降低乙酸的含量从而实现重组菌的高密度发酵。 Lee等用中空纤维膜过滤装置除去乙酸，可以在较高的葡 萄糖浓度下培养重组菌而得到较高的密度
酵母菌
最大生长速率是大肠杆菌的25% 酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。酵母有简单糖基 化能力和分泌蛋白的能力。
主要问题 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难， 外源蛋白分泌到胞外也有限，现在发展了其他的酵母如甲醇营 养型酵母等。 当产生是外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰时，低等真 核细胞就不能适应，要用动物细胞组织培养来达到。
4、哺乳动物细胞
哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且 所有转录后处理与在整个动物中相同，在某种情况 下可能转录后修饰有些不同但它可提供最接近于天 然副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞外。
但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达 水平较低。用于重组DNA 生产蛋白的最常用的宿主 是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。
酿酒酵母最先内用来作为外源基因的表达宿主菌之一，由于人 们对酿酒酵母（S.Cerevisiae）的遗传学和生理学背景了解得 多，及其表达的安全性。 但酿酒酵母表达系统也存在一些问题：
一是缺乏强有力的严格调控的启动子。目前一些常用的启动子 很难精确控制或需要大量昂贵的诱导物，如半乳糖苷酶启动子 需要半乳糖的诱导； 二是分泌效率低，特别是对分子量大于30KD的外源蛋白几乎 不分泌； 三是表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失； 四是不适于高密度培养。
主要问题
•是大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在细胞内，当这些 蛋白达到高浓度时，会被水解或形成不溶的包含体。包含体 中的蛋白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活性，必须重 新溶解并使它复性。
•触发热冲击响应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白水 解酶的活性。在一些情况下，细胞内蛋白水解酶是使蛋白的 降解速率几乎等于产生的速率。
（2）减少乙酸积累的对策 宿主菌 不同的宿主产生乙酸不同，可通过诱变使乙酸生成途 径中的两个关键酶，有一个突变了或活性降低了，使 乙酸合成受阻。 培养基 碳源的含量影响最大。 在基本培养基中大肠杆菌产生的乙酸比在复合培养基 中产生少。 甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成 Han等在培养基中加入某些氨基酸（甘氨酸、甲硫氨 酸）减轻了乙酸的抑制作用，提高了重组菌的生长速 率和重组蛋白的产率。
限制性流加葡萄糖 利用葡萄糖为碳源培养重组大肠杆菌时要控制其浓度 在较低的范围内，减少乙酸的生成。目前大多数高密 度发酵均采取了限制性流加葡萄糖的方法利用反馈的 参数，如pH，μ，OUR, CER作为控制对象，和葡萄糖 流加相关联，控制流加量，使培养基中葡萄糖的浓度 限定在较低水平。
五、重组大肠杆菌的高密度培养策略
第十二章 基因工程菌培养
一、概述
基因工程菌生产的主要产品有二类，蛋白质和非 蛋白质。 非蛋白质产物可以通过代谢工程细胞来获得，这 些细胞插入编码酶的DNA，产生新的途径或增强 某一途径，从而得到新的化合物或增加产量。
现代基因工程重点在蛋白质产物上，主要产品如 下：
• 细胞因子、疫苗、酶
• 产品最主要的用于人的治疗，此外还有用于畜牧业、食品 或工业用的生物催化剂。用于注射用的治疗蛋白要求高度纯化， 由于病人可能产生的强的免疫反应或副作用是灾难性的。
2、pH值对工程菌生长和表达的影响
3、诱导时间对外源蛋白表达的影响
诱导时间：加入诱导剂后的培养时间 随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细 胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分 解。
4、诱导时机对表达的影响
诱导时机对酶表达水平和活力的影响
生物量（A600） 酶活力
乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。Han认 为细菌在低比生长速率下通过氧化代谢的作用产生的能量足以 满足合成和异化的需求，不会产生乙酸，而在髙比生长速率时， 大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生 成途径储备ATP和NADH。
❖ 基因工程菌培养
乙酸的生成需要两个关键性的酶，磷酸转乙酰酶（Pta）和乙 酰激酶（Ack），它们催化葡萄糖代谢中从乙酰辅酶A生成乙 酸的两步酶促反应。

降低比生长速率
细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高，一般来 说，在合成培养基中，当重组菌的生长速率超过某个 临界值便产生乙酸。在连续培养中，当稀释速率超过 0.2h－1才能检测到乙酸的存在。较低的比生长速率虽 然产酸少，但同时对产物表达不利，因此选取合适的 比生长速率才能达到高密度、高表达发酵。
高表达的障碍是： 外源基因的不稳定，造成表达的下降。 高生长速率与高表达之间的矛盾 乙酸的产生 蛋白的降解
高密度培养的措施
分批补料培养以分批培养为基础，吸取了连续培养的优 点，可消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，还可弥 补低浓度底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控制了 菌体的生长过程。因此，要实现重组大肠杆菌的高密度 培养，最常用和最有效的方法就是分批补料流加培养法。 现在常用的是反馈补料培养。有几种反馈控制
（1）分离丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失。 质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和低拷贝质粒 （有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门 的机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常 很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，几乎 所有子细胞接受一些质粒，也有可能有的细胞没有接受质 粒，当然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分 裂中一个）。
(2)质粒结构不稳定性
除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留质粒，但质粒结构 发生改变，而不产生外源蛋白，减少对细胞的有害影响，这 就是结构不稳定性。
如果质粒发生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外 源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。 而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快，使 得在这种培养物中带有改变了的质粒占统治地位的菌，这种 培养情况就是结构不稳定性。
三、利用基因工程菌生产的特点
基因不稳定性
生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源 蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的， 失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多， 从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳 定性。
基因的不稳定性原因： 分离丢失 结构不稳定性 宿主细胞调节突变