基因工程菌的稳定性
基因工程菌质粒的稳定性
四、提高质粒稳定性的措施
1．选择合适的宿主菌和合适的载体 （1）宿主菌
（2）载体
大肠杆 菌
酵母菌
四、提高质粒稳定性的措施
2．选择适宜的培养方式
（1）两步发酵方式：生长阶段外源基因表达阶段 （2）控制基因过量表达
3．控制合适的培养条件 （1）施加选择压力 （2）培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有 利于稳定 （3）培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒 的稳定
4．采用固定化技术
1. 质粒的不稳定性有哪几种表现？ 2. 质粒不稳定性产生的机制有哪些？ 3. 影响质粒不稳定性的因素有哪些？ 4. 如何提高质粒的稳定性？
课程名称:生物工艺学
基因工程菌质粒的稳定性
1 质粒不稳定的表现 2 质粒不稳定性的产生机制 3 影响质粒稳定性的因素 4 提高质粒稳定性的措施
一、质粒不稳定的表现
n 质粒丢失：脱落性不稳定
由环境因素或生理、遗传学原因，质粒从宿主中 丢失，丢失率因环境、宿主、质粒结构而不同。
n 质粒的基因结构突变：结构不稳定性
在pH为6．0时，基因工程酵母表达乙肝表面抗原的质粒最稳定， 在pH值为5.0时，质粒最不稳定。
设法控制pH值在合适范围内，确保质粒的稳定性。
（3)溶解氧和搅拌
当溶解氧浓度在培养基中周期变化时，连续培养酵母的质粒稳 定性强烈依赖于生长速率，在较低生长速率下完全稳定。
增加氧浓度能引起细胞内氧化性胁迫，稳定阶段缺氧限制产物 的形成和质粒稳定性。
在不同培养基中基因工程菌，还存在质 粒丢失概率的差异；比生长速率也不同。
2．发酵操作方式
n 流加操作方式 n 两段连续培养 n 固定化后
细胞
凝胶网 格载体
半透膜 胶囊ຫໍສະໝຸດ 3．发酵培养条件（1）温度
(附具体方法)基因工程菌质粒(遗传)稳定性--原创
质粒遗传稳定性目前没有明确的规定，但一般用斜面传代法，一定数量点接抗性和非抗性板，生长计数（主要证明分裂稳定性）；更严谨时，可进一步双酶切、测序等验证（证明结构稳定性--国家药品监督管理局的新生物制品审批）。
工业用菌确实存在很多问题，免不了质粒丢失严重，高突变等现象，但是一般工业用菌都是经过10代以上稳定筛选之后才用于小试、中试和工业生产的。
菌体不稳定造可能成的损失巨大，所以鲜有工业用菌使用在2-3代菌就没有产量或者产量低的菌株。
一般来说，一代菌用一点少一点，一代菌上罐太伤了，工业用菌一般会存储足够量的二代菌（多数是冷冻干燥安瓿管）用于生产，在生产中需要活化、制作摇瓶种子，如果菌体生长慢，还要进一步做种子罐，最后才能用于生产。
如果菌体稳定性差，几代传下来，发酵的不稳定造成损失是很难估计的，而且一般不稳定菌都是先做小试、中试，成功后才能用于生产。
质粒在宿主中的稳定性确实需要进行筛选，实验中遇到的质粒突变能避免尽量避免，做好的质粒也不一定一直存放，由于不断的被用于各种改进实验，期间经过的大量筛选，避免了一代菌用完之后就没有更好的使用。
使用高保真酶扩增、保证没有物理化学因素促变，使用合适的宿主，还是很容易得到没有突变的质粒的，后续连续传代培养也可以得到比较稳定的质粒的。
质粒不稳定是重组基因工程菌培养过程中的常见问题，也是影响外源基因高效表达的限制因素之一[77~78]。
Koch[79]最早对外源基因引入宿主而对细胞产生的代谢负荷进行考察，研究表明质粒的大小、拷贝数，质粒的维持，抗性基因的表达，培养环境的变化，都会对宿主细胞产生代谢负荷，当供氧不足或营养物质受限制时，代谢负荷对细胞生长的影响会更加明显。
基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式: 一种是重组DNA 质粒的丢失, 称为脱落性不稳定; 另一种是质粒中的基因结构发生突变, 称为结构性不稳定。
基因工程菌培养及其不稳定性
5. 搅拌器转速和通气应适当
6. 空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料
7. 培养液要经化学处理或热处理后才可排放
8. 发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。
9. 轴封可采用磁力搅拌或双端面密封
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中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并
可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密
度菌体。
膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成
循环流速，开始透析的时间、透析培养的持续时间段都对产物的产率
有影响。
27
一、基因工程菌的培养方式
5. 固定化培养
基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。 有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化 后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别对分泌型菌 更为有利。 由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。
提高发酵罐的供氧能力。
有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因
而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从
而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的
方法都可提高质粒的稳定性。
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提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
pH pH 影响重组菌的稳定性。
5. 控制培养条件
限制性基质
一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养， 微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。
限制性基质的种类对重组菌有不同的影响
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提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
溶解氧
在基因重组菌的高密度培养时，为了ห้องสมุดไป่ตู้持所需的溶氧水平，除
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的培养方式
固定化培养 基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化
技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提 高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基 因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问 题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表 达。 连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行生长，维持菌 体的稳定性，在第二级进行表达。
第6节 基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性及其对策
基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 改善基因工程菌不稳定性的策略
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的表现
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种 不稳定性具有下列两种表现形式：
结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失
长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来， 根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。
基因工程菌培养方式
连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程
度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。 连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研
基因重组菌的比生长速率与培养环境有关，如温度，pH，溶氧，限 制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。在一定的温度和 pH 下，限制 性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。
基因工程菌的稳定性
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发酵罐的组成有：
发酵罐体、保证高传质作用的搅 拌器、精细的温度控制和灭菌系 统、空气无菌过滤装置、残留气 体处理装置、参数测量与控制系 统、培养液配制和连续操作系统。
对发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件， 培养过程不得污染， 保证纯菌培养， 培养及消毒过程不得游离异物， 不能干扰细菌代谢活动等。
温度还影响蛋白质的活性和包 含体的形成。
⒋ 溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重 要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用 率，则能提高发酵产率。
发酵时，随DO2浓度的下降， 细胞生长减慢，ST值下降，发酵后 期下降幅度更大。
外源基因的高效表达需要大量 的能量，促进细胞的呼吸作用，提 高对氧的需求。
第五节 基因工程菌的 稳定性
基因工程菌在传代过程中常 出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为： 分裂不稳定 结构不稳定
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一 定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢 失或碱基重排、缺失所致工程菌性 能的改变
重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究
重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究摘要基因工程菌中质粒稳定性对于基因工程菌的发酵有着重要影响，但基因工程菌在传代中经常出现质粒不稳定遗传的现象。
本试验通过在工程菌的培养过程中添加抗生素这一选择压力和诱导表达目的蛋白的方式来提高基因工程菌的稳定性，并通过双酶切电泳分析及高效率的诱导表达外源蛋白来进行检测，得出工程菌在LB（-）和LB（+）平板上都能生长且形态相似；电泳图平行、酶切片段的位置大致一致；诱导表达的外源基因的质粒稳定。
提高质粒稳定性有利于外源蛋白表达，以满足大规模生产发酵。
关键词：基因工程菌；质粒；稳定性-I-Study on the stability of plasmid of recombinanthuman IL-2 E.coli bacteriaAbstractEscherichia coli. plasmid stability for the genetic engineering of bacteria fermentation has important implications genetically engineered bacteria in the mid-recurring genetic instability of the plasmid. This experiment in engineering from the training course to add the option of antibiotic pressure and protein expression induced by way of reference high genetically engineered bacteria stability and digested by electrophoresis and high efficiency induced expression of foreign proteins to detect, the virus can grow in the panel of LB(-) and LB(+), and the morphology is similar; The electrophoregram is parallel, and the position of the fragment is consistenct roughly; Inducible expression of foreign genes is stabile. We improve the stabilization of the foreign gene in order to meet the large-scale fermentation.Key words: Genetic engineering ; plasmid ; stability-II-目录摘要 (I)ABSTRACT ............................................................................................................................... I I 前言. (1)1 材料与方法 (3)1.1试验材料 (3)1.1.1 菌种质粒 (3)1.1.2 培养基 (3)1.1.3 常用药品 (3)1.1.4试验仪器 (3)1.2试验方法 (3)1.2.1 基因工程菌的转化 (3)1.2.2 制平板 (3)1.2.3 连续传代 (3)1.2.4 鉴定 (4)2 结果与分析 (6)2.1不同代菌的传代结果 (6)2.2上述不同代质粒的电泳图 (8)2.3不同代质粒的酶切图 (9)2.4诱导表达不同代的基因工程菌的外源基因蛋白电泳图 (10)3 讨论 (11)3.1分析本试验所出现的问题 (11)3.2质粒稳定性影响的若干因素 (12)3.2.1 含调控型启动子的基因工程菌稳定性控制 (12)3.2.2 选择性培养基提高质粒稳定性 (12)3.2.3 培养操作方式对工程菌稳定性的影响 (12)3.2.4 培养条件对工程菌稳定性的影响 (12)4 结论 (14)参考文献 (15)致谢 (17)-III-前言随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展，运用重组表达技术来生产预防和治疗疾病的制品已成为近几年研究的热点。
工程菌的高效表达及稳定性护理课件
CHAPTER 03
工程菌的稳定性护理
菌种保藏技术
01
02
03
低温保藏
将工程菌种保存在低温环 境下，如-80°C或-196°C ，以减缓菌种生长和变异 的速度。
真空干燥保藏
通过去除水分，降低菌种 活性，延长保藏时间。
基因编辑技术将有助于发现和鉴定新的基因和蛋白质，进 一步拓展工程菌的应用领域。
新型表达载体的研发
新型表达载体是提高工程菌表达效率 和稳定性的关键，未来将会有更多高 效、稳定的新型表达载体被研发和应 用。
新型表达载体将有助于解决现有表达 载体存在的问题，如表达水平低、易 污染等，进一步提高工程菌的应用价 值。
表达载体技术主要涉及载体的设计和 改造、外源基因的插入和表达调控等 。
表达载体技术的关键在于选择合适的 载体和构建高效的载体系统，以提高 外源基因的表达水平和稳定性。
培养优化技术
培养优化技术是通过优化培养条件，提高工程菌的生长和代谢速率，从而提高目标 产物的产量。
培养优化技术主要涉及温度、pH、氧气、营养物质等培养条件的调节和控制。
添加稳定剂
在培养基中添加抗氧化剂、抗紫 外线和重金属等稳定剂，提高工 程菌的抗逆性。
培养条件控制
温度控制
保持恒定的培养温度，避 免温度波动对工程菌生长 和稳定性的影响。
pH值控制
维持适宜的pH值范围，保 证工程菌的正常生长和代 谢。
溶氧量控制
根据工程菌的生长需求， 控制培养液中的溶氧量， 促进菌种的生长和稳定性 。
VS
工程菌的应用将有助于解决一些全球 性的问题，如抗生素耐药性、环境污 染等，对人类社会的可持续发展具有 重要意义。
工程菌传代稳定性方案
工程菌传代稳定性方案一、引言随着生物工程技术的不断发展，工程菌的传代稳定性成为一个重要的研究方向。
传代稳定性是指工程菌在持续传代过程中，其基因组和代谢特性不发生显著变化的能力。
传代稳定性的不稳定性会影响到工程菌在发酵、生产过程中的稳定性和可靠性，因此对于工程菌的传代稳定性进行深入研究具有重要的意义。
本文将对工程菌传代稳定性的影响因素及解决方案进行系统的论述。
二、工程菌传代稳定性影响因素1. 外源DNA插入点外源DNA在工程菌中的插入点会直接影响到工程菌的稳定性。
如果外源DNA插入到工程菌的基因组中的激活区域，可能会导致基因的过度表达或失活。
这种情况会对细胞的代谢特性产生明显影响，从而影响到工程菌的传代稳定性。
2. 外源DNA拷贝数外源DNA在工程菌中的拷贝数也是影响传代稳定性的一个重要因素。
外源DNA拷贝数过高可能会导致工程菌的基因组不稳定，进而影响到其传代稳定性。
而且外源DNA拷贝数过高还容易导致外源基因与细胞内自身基因发生重组，从而引起基因突变和适应性降低。
3. 环境条件环境条件对于工程菌的传代稳定性也有一定的影响。
例如，温度、pH值、营养条件等环境因素都可能影响到工程菌的代谢特性和遗传稳定性。
另外，在野外环境中，外源菌可能会受到生物环境因素的影响，加速了基因突变的发生。
三、工程菌传代稳定性解决方案1. 合理设计外源DNA插入点在进行工程菌的遗传改造时，应该注意选择适当的外源DNA插入点。
合理的外源DNA插入点可以降低外源DNA对细胞代谢特性的影响，减少基因的过度表达或失活等现象，从而提高工程菌的传代稳定性。
2. 精细调控外源DNA拷贝数在进行工程菌的遗传改造时，应该对外源DNA的拷贝数进行精细调控。
避免外源DNA拷贝数过高，减少基因突变和适应性降低的发生概率，从而提高工程菌的传代稳定性。
3. 优化环境条件在工程菌的发酵、生产过程中，应该优化环境条件，保持细胞的代谢稳定性。
保持适宜的温度、pH值和营养条件，可以减少外源菌受生物环境因素的影响，降低基因突变的发生概率。
基因工程菌的不稳定性
• 工程菌的培养一般分为2个阶段： （1）第一阶段----先使菌体生长至一定密度。 （2）第二阶段----开始诱导外源基因的表达。
• 由于第一阶段外源基因没有表达，减少了 丢失质粒的细菌的产生概率，也就增加了
工程菌的稳定性。
• 因为丢失质 粒的细菌在 含的抗生素 的培养基环 境中是不能 正常生长的。
（2）然后随机挑选100个菌落，接种到含有 抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小 时，统计所长出的菌落数B；
（3）计算出B/A的比值。该比值能够反映出 质粒的稳定性。
• 因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养 基环境中是不能正常生长的。
பைடு நூலகம்
二、提高质粒稳定性的方法
1、分阶段培养法 2、在培养基中加入抗生素，形成选择性压力 3、通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧
• 含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代 菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在 使含质粒菌的工程菌的比生长速率明显低 于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生， 能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，对 质粒的稳定性不利。
质粒稳定性的分析方法
（1）将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂 于不含抗生素标记的平板培养基上，培养 10-12小时，统计所长出的菌落数A；
• 所以可以通 过加入抗生 素来抑制质 粒丢失的细 菌的生长。
• 通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的 综合调节措施
• 通过以下方法可以提高质粒的稳定性。
（1）间歇送氧 （2）改变稀释速率
基因工程菌的不稳定性
一、质粒不稳定产生的原因 分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比 例不含质粒子代菌的现象。(常见) 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或 碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变
第四章基因工程制药
3.基因工程技术最成功的成就:用于新型生物技术药物的研制
4.基因工程技术的主要工具: * Tool enzyme 工具酶:restriction enzyme, ligase, repair. * Nucleic acid and protein sequence:Basis for gene analyze and synthesis. * Transfer vector: gene transfer * Expression vector: Manufacture plant for gene replication and expression target products. Good Vectors: Ecol. ,---- High efficiency expression but glycoprotein Beer yeast , mammalian cell ----glycoprotein
5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测 序、确定基因的 转录方向、转录起始点等。）
二、化学合成法
较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成 法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基 因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序， 再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。
10mM Tris 1mM EDTA
纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图
Poly(A)mRNA
2、cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使
oligo(dT)选出的mRNA有5—30%被拷贝。
3、cDNA第二链的合成：
3.2第三章_基因工程菌的稳定性_生物制药
遗传特性
载体的选择 宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上 培养基 生长速率 限制性基质 温度 pH 和溶氧 外源基因表达
发酵工艺
改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：
1.将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 2.正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 3.将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因
的稳定性，在第二级进行表达。
提高基因工程菌稳定性的策略
控制目的基因的过量表达
使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度
使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺
培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定
培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
提高基因工程菌稳定性的策略
分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、 连续培养中控制稀释速率等培养方法，都能在一定范围内控 制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用， 以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。 实质：控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和 呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的 产生，以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌 体生长速度。
连续培养：
连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度 后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。
连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研究
基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造了 良好的条件。 但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。在这
生化工程-基因工程菌培养
基因工程菌在生产过程中可能产生变异或逃逸，对环境和人体健康造成潜在威胁。因此，需要加强安全 监管和风险评估。
生物农药
生物农药
基因工程菌可用于生产生物农药，如杀虫剂、杀菌剂等。通过基因工程技术改良微生物， 使其产生具有杀虫、杀菌作用的代谢产物，实现对病虫害的有效防治。
生物农药的优势
生物农药具有环保、安全、可持续等优点，能够减少化学农药的使用，降低对环境的污 染和对人体的危害。
生物农药的挑战
生物农药的作用机制和效果可能受到环境因素的影响，如温度、湿度等，因此在实际应 用中需要加强效果评估和监测。
生物肥料
生物肥料
基因工程菌可用于生产生物肥料，通过改良微生物的代谢 途径，使其产生具有营养价值的代谢产物，如氮、磷、钾 等矿物质元素，为植物提供养分。
生物肥料的优势
生物肥料具有环保、安全、高效等优点，能够提高土壤肥 力和植物生长效率，减少化肥的使用和环境污染。
3
加强下游处理技术的研究
针对基因工程菌产生的难分离纯化的产物，未来 将加强下游处理技术的研究，提高产物的纯度和 收率。
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THANKS
基因工程菌能够高效降解有毒有 害物质或重金属离子，降低对环 境的污染和对生态系统的破坏。
生物环保的挑战
基因工程菌在降解过程中可能产 生变异或逃逸，对环境和人体健 康造成潜在威胁。因此，需要加 强安全监管和风险评估。
04
基因工程菌培养的挑战与前 景
基因工程菌培养的挑战
பைடு நூலகம்
基因工程菌种稳定性问题
培养基优化需求
基因表达技术
基因表达技术是指将重组后的目的基因导入宿主细胞中，并在宿主细胞中进行表达，产生相应的蛋白 质或代谢产物。
关于基因工程菌的稳定性
关于基因工程菌的稳定性摘要：研究了定态与周期操作对基因工程酒精酵母质粒稳定性的影响,周期操作有利于提高底物的利用率并增强质粒的稳定性；发现了固定化重组菌高稳定性的原因，另外还讨论了诸多培养条件对基因工程菌稳定性的影响。
关键字：固定化；基因工程菌；质粒；稳定性；基因工程基因工程菌就是将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌成为基因工程菌。
基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为：分裂不稳定和结构不稳定。
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
1 常见分裂不稳定的两个因素：1.1 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；1.2 这两种菌比数率差异的大小。
2 提高质粒稳定性的方法2.1 选择合适的宿主菌；2.2 选择合适的载体，适当增加质粒拷贝数；2.3 加入选择性压力；2.4 采用两阶段培养法；先使菌体生长至一定密度，再诱导外源基因的表达。
由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。
在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。
调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。
有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。
通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。
2.5 控制工程菌的培养条件；2.6 采用固定化培养基因工程技术是生物技术的核心和关键,已成功地表达了一系列与人类健康有关的重要多肽物质以及使多种氨基酸和抗生素增产,对人类社会生活产生了深远的影响。
基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式:一种是重组ＤＮＡ质粒的丢失,称为脱落性不稳定;另一种是质粒中的基因结构发生突变,称为结构性不稳定。
这两种不稳定都能使细胞失去生产能力。
[1174]《生物药学》
![[1174]《生物药学》](https://img.taocdn.com/s3/m/2b1cf2063968011ca3009167.png)
西南大学网络与继续教育学院课程代码： 1174 学年学季：20192单项选择题1、基因工程菌的稳定性至少要维持在（）以上. 30. 25. 40. 202、改造鼠源性单克隆抗体的首要目的是（）.降低免疫源性.延长半衰期.降低相对分子量.增加组织通透性3、基因工程菌的高密度发酵过程中，目前普遍采用（）作为发酵培养基的碳源.葡萄糖.甘油.甘露醇.蔗糖4、以下可用于菌种纯化的方法有（）.诱变处理.富集培养.高温灭菌.平板划线5、第三代抗体是指：（）.利用基因工程技术制备的基因工程抗体.融合细胞产生的单克隆抗体.多发性骨髓瘤细胞产生的免疫球蛋白. B淋巴细胞合成和分泌的球蛋白6、获得目的基因最常用的方法是：.化学合成法.逆转录法. DNA探针技术. PCR 技术7、促红细胞生长素（EPO）基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细.人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定.人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用.大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活.大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化8、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：（）.表达产物为糖基化蛋白质.表达产物为天然产物.容易培养，产物提纯简单.表达产物存在的部位是在菌体内9、外源基因在动物细胞与大肠杆菌中表达产物的主要区别是（）.糖基化.疗效可靠.产量高.性质稳定10、筛选杂交瘤细胞（脾-瘤融合细胞）选用的培养基是：（）. BME. RMP1640. HT. HAT11、鼠源性单克隆抗体改造后得到小分子抗体，常用的是（）.单链抗体. Fab 片段抗体.单域抗体.最小识别单位12、目前分离的1000多种抗生素，约2/3产自（）.病毒.细菌.放线菌.真菌13、基因表达最常用的宿主菌是：（）.大肠杆菌.枯草芽孢杆菌.酵母.链霉菌14、第三代生物技术（）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围. F. 海洋生物技术.细胞工程技术.基因工程技术.蛋白质工程技术15、发酵生产中培养基的成分是( ).碳源硫源无机盐和水.碳源氮源和水.碳源氮源无机盐微量元素和水.碳源氮源碱土金属元素和水16、人类第一个基因工程药物是：（）.人胰岛素.乙型肝炎疫苗.重组链激酶.促红细胞生成素主观题17、细胞因子参考答案：由细胞分泌的能调节生物有机体生理功能，参与细胞的增殖、分化和凋亡的小分子多肽物质18、生物药物参考答案：利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学、生病的制品19、发酵工程制药参考答案：采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的药品，或直接把微生物应20、胰岛素参考答案：是胰脏的内分泌组织。
微生物基因工程菌
具有高效性、可操作性和可预测 性，能够实现快速、准确地对微 生物进行定向改造。
微生物基因工程菌的应用领域
01
02
03
生物医药领域
生产重组蛋白药物、抗体 药物、疫苗等，提高药物 质量和产量。
工业领域
生产高值化学品、生物燃 料、生物塑料等，提高生 产效率和降低成本。
环境治理领域
修复污染环境、降解有机 污染物等，改善环境质量 。
微生物基因工程菌
汇报人： 202X-12-21
目 录
• 微生物基因工程菌概述 • 微生物基因工程菌的构建与优化 • 微生物基因工程菌的发酵工艺研究 • 微生物基因工程菌的应用研究 • 微生物基因工程菌的未来发展趋势与挑战
01
微生物基因工程菌概述
定义与特点
定义
微生物基因工程菌是指通过基因 工程技术对微生物进行改造和优 化，以获得具有特定性状的工程 菌。
通过选择合适的培养基、控制 培养条件、优化基因型等方法 提高基因工程菌的稳定性和可
重复性。
03
微生物基因工程菌的发 酵工艺研究
发酵工艺流程及影响因素
菌种选育
选择适合表达目标产物 的菌种，进行遗传改良
和筛选。
种子制备
通过培养基优化、接种 量、接种时间等因素，
制备活力强的种子。
发酵培养基
选择适合菌种生长和目 标产物表达的培养基， 包括碳源、氮源、无机
在农业领域的应用
1 2
生物肥料研发
通过基因工程技术改造微生物，生产具有固氮、 解磷、解钾等功能的生物肥料，提高土壤肥力和 农作物产量。
植物生长调节剂研发
利用微生物基因工程菌生产植物生长调节剂，促 进植物生长和发育，提高农作物产量和品质。
斑马鱼干扰素基因工程菌发酵条件及稳定性研究
生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2009年第2期·研究报告·收稿日期：2008-07-23基金项目：国家自然科学基金（30771658），国家863项目（2007AA10Z409）作者简介：梁晶晶（1986-），女，在读硕士，研究方向：渔业环境保护；E -mail ：ljlj.abcd@通讯作者：陆开宏（1964-），男，教授，博士生导师，研究方向：水域生态学；E -mail ：lukaihong@干扰素（interferon ，IFN ）是人和动物细胞、机体受到病毒感染时，受体细胞分泌的一种微量的具有光谱抗病毒活性、抗肿瘤作用的糖蛋白[1，2]，是脊椎动物抵抗病毒入侵的第一道防御系统，是最早的细胞功能调节系统[3]。
1957年Isaacs 和Lindenmann [4]在用鸡胚研究流感病毒干扰现象时发现的。
干扰素活性非常高，据研究表明1mg 纯化的干扰素有10亿个活性单位，所以1个IFN 分子就可以使1个机体细胞产生抗病毒状态[5]。
自1965年，Gravell 和M -alsberger [6]首次在黑头软头鲦中发现鱼类干扰素活性物质以来，近几年陆续在虹鳟（Salmo gairdneri ）、鲤（Cyprinus carpio ）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus ）、鲫鱼（Carassius auratus ）、大马哈鱼（Oncorhynchus k -eta ）、牙鲆（Paralichthys olivaceus ）、舌齿鲈（Dicentra -chus labrax ）、斑马鱼（Brachydanio rerio ）、大西洋鲑（Salmo salar ）等鱼体或培养细胞系检测到干扰素活性物质[1，7～12]。
2003年，Altmann 等[12]率先从斑马鱼EST 数据库中鉴定了一个与鸡IFN -α基因同源性约36%的斑马鱼EST ，从而克隆了斑马鱼IFN （zIFN ）基因，并斑马鱼干扰素基因工程菌发酵条件及稳定性研究梁晶晶1陆开宏1凌红丽2王宏华2（1宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波315211；2青岛康地恩实业有限公司，青岛266111）摘要：采用液体传代的方法，研究表达斑马鱼干扰素（ＩＦＮ）工程菌株pRSET -B -zIFN 的遗传稳定性，并对其发酵工艺进行了优化。
工程菌
• 原因：在细胞分裂过程中，有一个子 细胞没有获得质粒 DNΑ拷贝，并最终 增殖成为无质粒的优势群体
质粒结构的不稳定
定义：指外源基因从质粒上丢失或 者碱基重排、缺失而导致的工程菌 性能的改变 原因：由转位作用和重组作用所引 起的质粒DNΑ的重排与缺失。
1. 质粒不稳定产生的原因
• 质粒的不稳定是指工程菌分裂时出现一定 比例不含质粒子代菌的现象。
⒋ 溶解氧
• 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼 吸。 • 当溶解氧强度大时生长速率较高，染色体复制 增加， • 若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高 发酵产率 • 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中 的氧供给，提高活菌产量。 • 温和的搅拌速率适于保存质粒的稳定性。在搅 拌罐发酵时，质粒拷贝数通常比摇瓶培养低
⒉接种量
• 接种量的大小影响发酵的产量和 发酵周期。
• 接种量小，菌体延迟期较长，使 菌龄老化，不利于外源基因表达。
⒊ 温度
• 有的质粒属温度敏感型质粒，如农杆 菌质粒，当农杆菌培养温度超过30℃， 即引起质粒丢失；Kwang H.Son等也发 现培养温度处于30℃～44℃时，巨大 芽孢杆菌PCK108质粒结构基本稳定， 而且其目的产物——纤维素酶产量比 30℃时显著提高，但30℃时质粒稳定 性较强。
• 由于第一阶段外源基因未表达从而减少了 重组菌与质粒丢失菌的比生长速率的差别， 增加了质粒的稳定性。 • 连续培养时可以考虑采用多级培养，如在 第一级进行生长，维持菌体的稳定性，在 第二级进行表达。
发酵工艺条件的优化
对发酵影响较大的几个因素有： ⒈培养基的影响 ⒉接种量的影响 ⒊温度的影响 ⒋溶解氧的影响 5.pH的影响
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连续培养
不断地流加营养，并不断地取出发酵液。 连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。
透析培养
固定化培养
基因工程菌培养方式
补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，
间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。
在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
施加选择压力
根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素
药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力
载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份
在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优
化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获 得最高利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目 的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。
第七节 基因工程菌的培养
一、基因工程菌的培养方式 二、基因工程菌的发酵工艺
基因工程菌培养方式
基因工程菌发酵的基本操作方式有：
分批培养 分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限
半连续培养（补料分批）
在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的 生长，或得到更多的代谢产物
提高基因工程菌稳定性的策略
优化基因工程菌的培养工艺 工程菌的培养条件对其质粒的稳定性和表达效率影响很大 可调控的环境参数为：培养基组分、培养温度、pH 和溶解氧浓度。
有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用
间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质 粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提 高质粒的稳定性。 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
质粒，保持基因工程菌的遗传特性，因而对发酵罐的要求十分严格。由于 生化工程学和计算机的发展，新型自动化发酵罐完全能满足这些要求。 常规的微生物发酵设备可直接用于基因工程菌的培养。不同点在于， 微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要 目标。 基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物。由于这类物质是 相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
控制目的基因的过量表达
使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
提高质粒稳定性的方法
采用膜透析装置是在发酵过程中用蠕动泵将发酵液抽出打入罐外的膜透
析器的一侧循环，其另一侧通入透析液循环，在补料分批培养中，大量乙酸 在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并可通过在透析液中补 充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密度菌体。 膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成，循 环流速，开始透析的时间和透析培养的持续时间段都对产物的产率有影响。
时，通常都需要维持一定的 pH 和溶氧水平。在基因重组菌的高密度培养
时，为了维持所需的溶氧水平，除了提高搅拌转速和通气量，往往还要在 通入的空气中补充氧气，以提高发酵罐的供氧能力。
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
外源基因的表达
外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定
外源基因高效表达时，有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等干
基因工程菌的培养设备
基因工程菌在发酵培养过程中要求
环境条件恒定，不影响其遗传特性，更不能引起所带质粒丢失。
对发酵罐有特殊要求 如要提供菌体生长的最适条件 培养过程不得污染 保证纯菌培养
培养及消毒过程中不得游离出异物，干扰细菌代谢活动
基因工程菌的培养设备
发酵罐的结构材料的稳定性要好，一般要应用不锈钢制成 罐体表面光滑易清洗，灭菌时没有死角 与发酵罐连接的阀门要用膜式阀，不用球形阀
培养基复杂，成本较高
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
分阶段控制培养
因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制
在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问 题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表 达。 连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行生长，维持菌 体的稳定性，在第二级进行表达。
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
固定化 固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性 基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的 表达率都有了很大提高。
在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压力稳定质
粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法 后，这种选择压力则可被省去。 不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。
将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞
正确设置载体上的多克隆位点
禁止 DNA 片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因 （DNA 单链结合蛋白编码基因）
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
需要的蛋白质，因此，培养设备以及设备控制应满足获得高浓度的受体细
胞和高表达的基因表达产物。
基因工程菌的培养设备
发酵罐的组成部分有：
发酵罐体
保证高传质作用的搅拌器、 精细的温度控制和灭菌系统、 空气无菌过滤装置 残留气体处理装置
参数测量与控制系统（如 pH、O2、CO2 等）
培养液配制及连续操作装置等。
数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧
基因工程菌的稳定性
影响基因工程菌稳定性的因素
载体的选择 遗传特性 宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上 培养基
生长速率
发酵工艺 限制性基质 温度
pH 和溶氧
外源基因表达
基因工程菌的稳定性
提高基因工程菌稳定性的策略
改进载体受体系统
以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
控制培养条件 有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用 间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒 的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质
粒的稳定性。
例如研究表达干扰素 a 的大肠杆菌 W3110(pEC901) 在不同比生长 速率下的质粒稳定性，随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰 素的比效价也明显增大.
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生
应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
限制性基质
一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物 的生长通常会受到一种或几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不 同的影响
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
pH 和溶解氧
pH 和溶氧影响重组酵母菌的稳定性。
pH 和溶氧是影响微生物生长的重要参数，在发酵罐培养基因重组菌
所有的连接接口均要用密封圈封闭，不留“死腔”，不得有泄漏
搅拌器转速和通气应适当 空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料 培养液要经化学处理或热处理后才可排放 发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。
轴封可采用磁力搅拌或双端面密封
培养基
一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培 养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质，
微生物的生长较在基本培养基中快。
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
比生长速率
基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速 率有助于提高质粒稳定性。 基因重组菌的比生长速率与培养环境有关，如温度，pH，溶氧，限 制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。在一定的温度和 pH 下，限制 性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生
应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排
扰宿主细胞的正常代谢活动，并造成质粒不稳定。
例如，吲哚丙烯酸（IAA ）是 trp 操纵子阻遏物的部分去阻遏剂，在 培养大肠杆菌 MV12（pVH5）时，在培养基中加入不同量的 IAA，发现 随 IAA 量的增加，pVH5 带有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表达 水平有很大提高，同时比生长速率下降，培养液中 Trp－ 的比例上升。电 泳分析表明 60%～70% 色氨酸合成能力丧失是由于质粒结构的变化，其 余是由于质粒丢失造成。
长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来，