镇静类兽药的残留量分析方法

镇静类兽药的残留量分析方法
一．HPLC在线紫外光谱测定和离线TLC确证测定
猪肾中镇定药和咔唑心安的残留量
(欧盟确证法)
Tranquillizers and Carazolol - An HPLC Method with On-line UN Spectrum Identification and Off-line TLC Confimation for Residues in Pig Kidneys
(Cy4.5 Confirming Method)
1 主题内容
镇定药和β-受体阻滞药咔唑心安在兽医处方中用于消除猪的紧张。

特别是在转运至屠宰场的过程中防止猪死亡和掉膘而用药，从用药到屠宰一般不超过几个小时，这就可能导致在可食部分有这类药物高残留量。

在欧盟，许多镇定药和咔唑心安会在不同情况下使用。

为了保证农场主在未经许可的情况下在产肉家畜中限制使用或者不用这些药物，可在屠宰场抽取肾脏样品，并用各种方法对此类化合物进行检测。

不论何时，如出现阳性检测结果，都必须进行确证。

按照残留指令(86/469/EEC)并采用本方法进行检测。

2 应用范围
本方法用于猪肾中6种镇定药和咔唑心安残留量的确证。

镇定药和咔唑心安的鉴定限量为1-2.5μg/kg肾脏。

氮哌酮形成的主要代谢物是氮哌醇，在残留量测定中需同时测定这两种化合物。

镇定药或咔唑心安的残留量表述为经所述方法测得肾中镇定药或咔唑心安的量，以μg/kg表示。

3 方法提要
本方法包括4个步骤
3.1 用乙醚提取经碱性匀浆的肾脏样品;
3.2 用硅基二醇柱净化;
3.3 用HPLC二极管阵列检测器分析和分级洗脱;
3.4 对选定的HPLC分离物用TLC进行镇定药和咔唑心安的确证。

4 试剂和材料
注1：除另有说明，化学试剂均为分析纯并来自Merck，水为去离子水或蒸馏水。

注2：本方法中采用了所列公司品牌的试剂，其它来源的符合要求的试剂也可等同使用。

4.1 化学试剂
4.1.1乙酸乙酯
4.1.2乙醇
4.1.3氯仿
4.1.4己烷
4.1.5 乙腈,HPLC级
4.1.6氢氧化钠
4.1.7 乙醚
4.1.8无水硫酸钠
4.1.9低沸点石油醚，沸程40-60℃
4.1.10浓硫酸
4.1.11乙酸铵
4.1.12 丙酮
4.1.13二氯甲烷
4.1.14 氨水
4.1.15硝酸铋（Ⅲ价）
4.1.16 冰乙酸
4.1.17 碘化钾
4.1.18香草醛
4.1.1985％磷酸溶液
4.2溶液
4.2.1乙腈+水（80+20,V/V）。

4.2.2乙腈+水（60+40,V/V）。

4.2.3乙腈+水（60+40,V/V）,含有0.1mol/L乙酸铵。

4.2.4乙腈+水+1mol/L乙酸铵（44.5+54.5+1，V/V/V）。

4.2.5薄层色谱（TLC）试剂。

4.2.
5.1展开剂Ⅰ；丙酮+二氯甲烷+25%氨水（40+60+1，V/V/V）。

4.2.
5.2 展开剂Ⅱ；丙酮+25%氨水（100+0.1，V/V）。

4.2.
5.3展开剂III；丙酮。

4.2.6 TLC显色剂
4.2.6.1Dragendorff试剂；0.8g 硝酸铋（Ⅲ价）溶于10mL冰乙酸和40mL蒸馏水中，8g碘化钾溶于20mL蒸馏水中，将两种溶液混合后储于暗处。

配制工作试剂时将6mL上述溶液与12mL冰乙酸、100mL乙醇（96%，V/V）和100mL乙醚混合，用前现配。

4.2.6.2香草醛－磷酸试剂；将3g香草醛溶于100mL乙醇（96%，V/V）中，然后边搅拌边加入75mL 85%磷酸、50mL蒸馏水和50mL乙醚。

4.2.6.3 硫酸试剂：加20mL浓硫酸于100mL乙醇（96%，V/V）中，冷却后再加20mL 乙醚。

4.3标准物质：氮哌酮和氟哌啶醇(Janssen Pharmaceutica) ；乙酰丙嗪(Clin Midy) ；氯丙嗪(Sigma) ；丙酰丙嗪和甲苯噻嗪(Bayer)。

4.3.1组分Ⅰ是浓度为2μg/L的氮哌酮和氮哌醇氯仿溶液。

4.3.2组分Ⅱ是浓度为1μg/L的咔唑心安、氟哌啶醇和甲苯噻嗪氯仿溶液。

4.3.3 组分Ⅲ是浓度为1μg/L的乙酰丙嗪、丙酰丙嗪和氯丙嗪氯仿溶液。

4.4安全操作与注意事项
有机溶剂：所有的有机溶剂都必须作为潜在的有害物对待，使用时必须在通风橱中进行。

5 仪器设备
仪器设备所注明的生产公司和型号仅供参考，同类型性能相当的其它产品也适用。

5.1玻璃仪器
普通等级的小型实验室玻璃仪器
5.2仪器
5.2.1Ultra-Turrax均质器
5.2.2 Buchli带真空泵的旋转蒸发仪
5.2.3 95℃水浴
5.2.4 45℃水浴，具有氮气吹扫管以蒸发溶剂
5.2.5HAMILTON色谱用玻璃注射器
5.2.6 硅基二醇柱(Baker 70-9403)，提取前用3mL乙醇和3mL乙醚冲洗。

5.2.7 Baker 10 SPE系统
5.3 HPLC仪器
系统包括一个带有LKB 2152控制器的LKB2150泵，一个LKB 2212馏分收集器，一个Hewlett Packard 1040A二极管阵列检测器，一个作为反相前置柱的Chromguard置换柱(10mm×3mm i.d.)和一个填充SAS-Hypersil (5μm) (Shandon)的分析柱(150mm×4.6mm i.d.)，溶剂4.2.4作为流动相，流速为2mL/min。

在235nm处检测洗脱物并分别收集3个洗脱馏分，第一组馏分包括氮哌酮和氮哌醇，第二组馏分包括咔唑心安、甲苯噻嗪和氟哌啶醇，第三组馏分包括乙酰丙嗪、丙酰丙嗪和氯丙嗪。

5.4 TLC装置，包括展开槽、喷雾器、点样器
5.4.1TLC色谱板，HPTLC-Fertigplatten Kieselgel-60型(Merck)。

5.4.2TLC色谱板用的70℃或120℃的烘箱。

6 样品和抽制样程序
依据欧盟兽药残留量分析方法对样品和抽制样程序的要求，遵照国际标准化组织文本[ISO 78/2-1982(E)]和欧盟指令（2052/Ⅵ/84-EN）附录Ⅱ的有关规定列出技术要求如下：6.1样品的性状：肾脏样品应该能够进行残留量的检测。

6.2样品量：样品量应能满足按此方法进行检验并在必要时进行重复分析的需要。

6.3肾脏样品在抽取后必须马上冷冻保存，在分析前的保存温度必须≤-20℃。

7 测定步骤
7.1解冻肾脏样品，去掉髓质。

7.2在Ultra-Turrax均质器(5.2.1)中均质50g已去除髓质的样品。

7.3加4mL 5mol/L NaOH到20g均质样品中。

7.4为了控制检测质量，将标准混合液加入没有用过镇定药和咔唑心安的猪（控制猪－空白样品）的肾脏样品中，在室温下至少放置30min，或者+4℃过夜。

7.5所得悬浮液在95℃水浴中保温1h。

7.6冷至室温，用70mL乙醚提取。

7.7加入10g无水硫酸钠脱水后过滤。

7.8加入20mL低沸点石油醚（4.1.9）。

7.9固相提取
7.9.1用50mL漏斗将粗提取物加入固相提取柱中（5.2.6）。

7.9.2用3mL乙醚，3mL乙醇，1mL乙腈：水（80:20 V/V）（4.2.1），3 mL乙腈：水（60:40 V/V）（4.2.2）洗涤。

7.9.3 用1.5mL含有0.1mol/L乙酸铵的乙腈：水（60:40 V/V）冲洗柱子，洗脱液收集在装有0.025mL 5mol/L NaOH溶液的试管中。

7.10加入1mL丙酮后挥干溶剂。

7.11 将干的残留量溶解于0.1mL水后用2.5mL正己烷提取。

将正己烷提取物挥发干后重新溶解在0.07mL HPLC洗脱液（4.2.4）中。

7.12 HPLC。

在HPLC系统中进样0.055mL 7.11提取物。

用装有0.05mL 5mol/L NaOH溶液的3个试管收集5.3所述的3组馏分。

7.13 用氮气流将各组馏分的体积浓缩至原来的一半。

7.14用2×2mL乙醚提取各组馏分，加0.5g无水硫酸钠脱水后将乙醚挥干。

7.15将0.4mL乙醇加入提取物中，保存在-20℃暗处，直至TLC分析。

7.16 TLC。

检测系统基于Haagsma et., (1988)的工作。

7.16.1将7.15提取物挥发干后溶解于0.05mL氯仿中，对每一组馏分在两块TLC色谱板(A&B)上点样0.015mL，在B板上点上0.005mL对应的标准溶液(4.3)。

7.16.2第一组馏分提取物(参见5.3)在展开剂Ⅰ (4.2.5.1)中预展，挥干，再在展开剂Ⅲ(4.2.5.3)中展开，挥干，在Dragendorff试剂(4.2.6.1)中浸几秒钟。

挥干2－5min后氮哌酮和氮哌酮的斑点显色出来，如果显色程度不够，可进行如下处理：将薄层板在70℃加热5min，冷至室温后放入香草醛－磷酸溶液中，挥干10min后用紫外发光器的365nm光检查色谱板，镇定药变成可见的红色斑点。

在70℃下将色谱板加热5min可以加快这个过程。

7.16.2第二组馏分提取物按同样的方法处理，除了用展开剂Ⅱ(4.2.5.2)代替展开剂Ⅲ。

然而对咔唑心安的检测，薄层板在用香草醛－磷酸溶液处理后进行加热是必需的，有时候还需要在120℃加热5min。

7.16.3第三组馏分提取液在展开剂Ⅰ中预展，挥干，在展开剂Ⅱ中展开，挥干后在120℃加热1min。

将薄层板在硫酸试剂(4.2.6.3)中浸几秒钟后在120℃加热4min。

冷后将薄层板在Dragendorff试剂中浸几秒钟，挥干后镇定药变成可见的深褐色斑点。

8 结果计算和表述
8.1高效液相色谱法对镇定药和咔唑心安在235nm处的检测限根据本书第5章中的所述规定进行确定。

例如，检测限等于具代表性的空白样品测定值之平均值加上其平均值的三倍标准偏差。

基于二极管阵列检测系统的鉴定极限是这样定义的：在检测系统分辨率所决定的界限里，分析物谱图中的最大吸收波长应该与标准物质相同，对于二极管阵列检测器该界限一般在±2nm之间。

在相对吸光度大于标准物质吸光度10%的光谱区域，分析物的光谱与标准物质的光谱不应有差别。

当出现相同的最大吸收峰并且在超过标准物质吸光度的10%的光谱部分，两者没有差异时，则该判据标准是符合的。

文献Van Ginkel et al., (1989)中HPLC和TLC的检测限以及HPLC二极管阵列检测器的鉴定极限列于表1。

表1
化合物检测限(μg/kg) 鉴定极限(μg/kg) 回收率，n=6
HPLC TLC % SD(%)
氮哌醇＜1 1 2.5 64 4.4
氮哌酮＜1 1 2.5 60 2.3
咔唑心安＜1 0.3 1 56 7.5
甲苯噻嗪 2.5 3 10 31 7.0
氟哌啶醇 2.5 6 10 59 6.0
乙酰丙嗪 5 0.3 10 55 3.9
丙酰丙嗪 5 0.3 10 61 11
氯丙嗪10 0.3 25 59 11
8.2回收率
文献（Van Ginkel et al., 1989）报道了添加浓度为检测限的1-5倍时测得的镇定药和咔唑心安的回收率（见表1）。

这些物质的回收率是由它们的相对UV吸光度计算的，这些数值相当于HPLC馏分的实际回收率，没有进行等分因子校正。

除甲苯噻嗪外，所有的回收率都在55－64％之间，甲苯噻嗪的低回收率是由SPE柱的洗脱不完全引起的。

9 检验流程图
均质肾脏碱浸提用乙醚提取SPE净化HPLC TLC 结果。

10 参考文献[1]～[6]
(邹伟林峰)
二．GC-MS法确证测定猪肾中镇定药的残留量
(欧盟确证法)
Tranquillizers-Identification Using GC-MS Confirmation for Residues of
Tranquillizers in Pig Kidneys
(Cy4.6 Confirming Method)
1 主题内容
镇定药和β-受体阻滞药咔唑心安在兽医处方中用于消除猪的紧张。

特别是在转运至屠宰场的过程中防止猪死亡和掉膘而用药。

从用药到屠宰一般不超过几个小时，这就可能导致在可食部分有这类药物高残留量。

在欧盟，许多镇定药和咔唑心安会在不同情况下使用。

为了保证农场主在未经许可的情况下在产肉家畜中限制使用或者不用这些药物，可在屠宰场抽取肾脏样品，并用各种方法对此类化合物进行检测。

不论何时，如出现阳性检测结果，都必须进行确证。

按照残留指令(86/469/EEC)并采用本方法进行检测。

2 应用范围
本方法用于猪肾中5种镇定药的确证。

镇定药的鉴定限量为50ug/kg肾。

氮哌酮主要代谢物为氮哌醇，在残留量测定中需同时测定这两种化合物。

本方法由荷兰RIKILT-DLO完成。

镇定药的残留量表述为经本方法测得肾中镇定药的量，以μg/kg表示。

3 方法提要
本方法包括4个步骤：
3.1用乙腈提取肾样品；
3.2用Sep-Pak C18柱净化；
3.3液液萃取；
3.4用GC-MS对所选HPLC分离组份进行镇定药确证。

4 试剂和材料
注1：除另有说明，化学试剂均为分析纯并来自Merck，水为去离子水或蒸馏水。

注2：本方法中采用了所列公司品牌的试剂，其它来源的符合要求的试剂也可等同使用。

4.1化学试剂
4.1.1 丙酮 (Merck-14)
4.1.2甲醇 (Merck-6009)
4.1.325％氨水溶液 (Merck-5432)
4.1.4 正己烷 (Merck-714)
4.1.5乙腈，HPLC级 (Merck-3)
4.1.6氯化钠 (Merck-6404)
4.1.7乙酸 (Merck-63)
4.1.8无水乙酸钠 (Merck-6268)
4.1.9浓硫酸(Merck-714)
4.1.10氢氧化钠
4.1.11叔丁基甲醚(Tert-butyk methyl ether)
4.1.12乙酸乙酯(UV级)(Merck-863)
4.2 溶液
4.2.1氯化钠溶液：溶解100g氯化钠于水中，定容至1L。

4.2.2硫酸溶液，0.01-0.05mol/L：将28mL浓硫酸（4.1.9）缓缓加入装有500mL水的烧杯中，待溶液冷至室温后，移取20～100mL该溶液至装有250mL水的1L烧杯中，加水至1L。

4.2.3酸性乙腈：在100 mL乙腈中加入1 mL 0.05M硫酸溶液（4.2.2）。

4.2.40.5mol/L 氢氧化钠：溶解20g氢氧化钠于600ml水中，并加水至1L。

4.3标准物质：乙酰丙嗪，氮哌醇和氟哌啶醇（荷兰，RIVM），盐酸氯丙嗪，丙酰丙嗪和甲苯噻嗪（Sigma）；氮哌酮（比利时，Janssen Pharm-Beerse）。

4.3.1标准储备液：准确称取某一标准物质10±1mg于100mL容量瓶中，用甲醇定容。

将该溶液储于4～8℃暗处，可稳定保存一年。

4.3.2标准工作液：移取1mL乙酰丙嗪和氟哌啶醇，盐酸氯丙嗪，丙酰丙嗪和氮哌酮标准储备液于100mL容量瓶中，用0.01~0.05mol/L硫酸溶液（4.2.2）定容至100mL。

每种标准品的浓度为1mg/L。

4.3.3氮哌酮和氮哌醇标准工作液：移取1mL氮哌酮和氮哌醇标准储备液于100mL容量瓶中，用0.01mol/L硫酸溶液(4.2.2)定容至100mL。

移取20mL该溶液至另一100mL容量瓶，用0.01mol/L硫酸溶液(4.2.2)定容至100mL。

每种标准品的浓度为0.2mg/L。

4.3.4GC-MS内标物：用乙酸乙酯配制2,3,4-2',4',5'-六氯联苯(PCB)(P，Wesel，德国)，使PCB浓度为2ng/μL。

4.4质控样品：以未检出残留药物的猪肾作为空白样品，添加标准溶液，使浓度为20μg/kg 和50μg/kg。

即移取100或250μL标准工作液4.3.2和(或)4.3.3至装有5g均质样品的80mL离心管中，提取前可放置10min。

4.5安全操作与注意事项
有机溶剂：所有的有机溶剂都必须作为潜在的有害物对待，使用时必须在通风橱中进行。

稀释浓硫酸时要小心。

5 仪器设备
仪器设备所注明的生产公司和型号仅供参考，同类型性能相当的其它产品也适用。

5.1分析天平。

5.2 普通玻璃仪器，包括100mL容量瓶。

5.3离心机（MSE-Coolspin）。

5.3.1聚丙烯离心管，容量80mL。

5.4超声波浴槽。

5.5Sep-Pak C18柱（Waters art. 51910）。

5.6加热恒温槽和氮气吹扫系统（Pierce Reacti Therm Module No 18790和Pierce Reacti Vap No 18780）。

5.7涡旋混合器。

5.8食品捣碎机(Moulinette)。

5.9注射器，50mL (Terumo)。

5.10pH计。

5.11GC-MS。

5.11.1 GC-MS是Hewlett Packard HP-MSD，配有HP5890A GC、HP5970B MSD、HP7673A 自动进样系统、HP59970C化学工作站。

5.11.2测定条件
GC柱：熔融石英毛细管柱，25m×0.22mm(i.d.)，涂0.12µm厚CP Sil-5涂层。

载气：氦气，线速度30cm/s。

分流：20ml/min，进样4分钟后打开。

隔膜吹扫：3ml/min，进样4分钟后打开。

进样温度：260℃
进样：5uL，不分流。

炉温：80-260℃；10℃/min；初始化保持2min；最后保持2min。

MS接口：直接连接柱子到离子源。

接口温度：260℃
质量范围：m/z 40-800
离子源：电子轰击(EI)，70ev。

测量时间：50ms
6 样品和抽制样程序
依据欧盟兽药残留量分析方法对样品和抽制样程序的要求，遵照国际标准化组织文本[ISO 78/2-1982(E)]和欧盟指令（2052/Ⅵ/84-EN）附录Ⅱ的有关规定列出技术要求如下：6.1样品的性状：应符合欧盟指令（64/433/EEC）的要求，能够进行肉中残留量的检测。

6.2 样品量：样品量应能满足按本方法进行检验和在必要时候的进行重复分析的需要。

6.3样品封识必须保证在实验室能正确地识别。

6.4在包装、储存和运输中必须保证样品的完整性和不会引起检测结果的偏差。

待分析镇定药的样品，在储存和运输时温度必须低于-18℃。

7 测定步骤
7.1在食品捣碎机(5.8)中均质肾脏样品。

7.2称取10g均质样品于80mL离心管中(5.3.1)。

7.3添加20mL乙腈于离心管中，在添加中样品必须置于涡旋混合器(5.7)上轻轻地混和。

将速度提高到1500 rpm并混合45 秒后，将离心管置于超声波浴(5.4)中2分钟，再以4000 g离心5分钟。

7.4 用Sep-Pak柱(5.5)净化。

7.4.1用5mL甲醇和5mL水活化小柱(5.5)。

7.4.2用注射器(5.9)排去柱中液体。

7.4.3将50mL 10%的氯化钠溶液(4.2.1)和7.5mL样品提取液(7.3)的上层清液混合，并过柱。

7.4.4将1mL 0.01M的硫酸溶液(4.2.2)和2mL空气依次过柱。

7.4.5取校准过的10mL试管，用氨水溶液(4.1.3)、水、甲醇和丙酮洗涤。

7.4.6用2mL酸性乙腈溶液(4.2.3)将分析物洗脱到上述试管(7.4.5) 中。

7.5 用加热装置在70℃和氮气流下，将洗出液浓缩至300uL。

注意不要蒸干。

7.6立即加1mL正己烷，并在涡旋混合器上以700 rpm混合30 秒后，以2000 g离心5分钟。

7.7弃去正己烷层，重复步骤7.6并弃去正己烷层。

7.8加入150µL 0.5M氢氧化钠，调节pH至10。

7.9慢慢地加入1mL叔丁基甲醚，涡旋混合30秒后，离心。

转移上层有机相到4mL试管中。

7.10重复步骤7.9两次。

7.11合并有机相，在30℃和氮气流下吹干。

7.12用25µL含有PCB内标的溶液(4.3.4)溶解残渣，并在涡旋混合器上混匀。

7.13进样5µL到GC-MS。

7.14在每组样品分析后，须紧接进样一个含有待测物质的标准溶液，浓度为0-10ng/µL。

7.15 操作注意事项：分析物对光不稳定。

将样品保存在暗处，测定工作只能在淡黄色的光线下进行。

8结果计算和表述
8.1质谱图可对照EC/93/256所列的标准进行评价。

在所有的镇定药中，除了甲苯噻嗪、氟哌啶醇和咔唑心安外，其它镇定药的四种离子的再现性都很好。

验证将不考虑甲苯噻嗪、氟哌啶醇和咔唑心安。

8.2保留时间的重现性。

保留时间以分钟表示，相应的百分变异系数在括号内。

十次分析的结果为：PCB 138 (内标)，16.25(1.5%)；甲苯噻嗪，12.731(4.2%)；氯丙嗪，17.593(2.0%)；氮哌酮，19.152(2.3%)；乙酰丙嗪，19.238(1.3%)；氮哌醇，19.599(2.6%)；丙酰丙嗪，19.817(2.0%)；氟哌啶醇，20.993(2.5%)。

8.3离子强度的重现性。

n=10，括号内表示变异系数CV。

浓度为5ng/µL。

分析物基峰
离子离子离子
m/z (CV%) m/z (CV%) m/z (CV%)
PCB 138 (内标) 360
甲苯噻嗪205 220 (19.0)u177 (13.8)u145 (16.0)u 氯丙嗪318 272 (1.1) 86 (3.3) 233 (2.6) 氮哌酮107 233 (3.6) 165 (3.6) 309 (4.6) 乙酰丙嗪326 280 (0.9) 241 (4.2) 197 (7.0) 氮哌醇107 235 (7.0) 121 (4.2) 222 (5.9) 丙酰丙嗪340 294 (3.8) 255 (3.3) 197 (5.0) 氟哌啶醇224 237 (6.0)u123 (12.2)u206 (11.7)u 注：a 上标u表示该结果未达到EC/93/256 标准。

b 离子按强度大小排列。

c 8.2和8.3数据来自Hooglan
d 等(1991)。

d 所有四种离子在浓度50μg/kg能被可靠地测定。

8.4 回收率：没获得数据。

回收率百分数应在下列范围：咔唑心安，84-113%；甲苯噻嗪，24-80%；氮哌酮，74-124%；氟哌啶醇，75-115%，乙酰丙嗪，78-124%；丙酰丙嗪，77-113%；氯丙嗪，58-128%。

9 检验流程图
均质肾脏用乙腈提取用C18 Sep-Pak小柱处理提取GC-MS
10 参考文献[1]～[9]
参考文献
[1] Commission Decision, 93/256/EEC, laying down the methods for detecting residues of
substances having a hormonal or thyrostatic action. [OJ. № L.118, 14.4.93. pp 64-74] [2] 2052/VI/84 File 6.11 II-4, Scientific Veterinary Committee, Working Group –“Reference
Methods for Residues”, General Criteria for the establishment of Reference Methods for the Detection of residues.
[3] ISO Standard 78/2/-1982 Layout for standards – Pard 2: Standard for Chemical Analysis
[4] ISO Standard 5725(1986)
[5] Van Ginkel, L.A., Schwillens, P.L.W.J. and Olling, M., (1989), Liquid chromatographic
method with on-line UV spectrum identification and off-line thin-layer chromatographic confirmation for the detection of tranquillizers and carazolol in pig kindneys. Anal. Chem.
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