镇静类兽药的残留量分析方法

镇静类兽药的残留量分析方法

一．HPLC在线紫外光谱测定和离线TLC确证测定

猪肾中镇定药和咔唑心安的残留量

(欧盟确证法)

Tranquillizers and Carazolol - An HPLC Method with On-line UN Spectrum Identification and Off-line TLC Confimation for Residues in Pig Kidneys

(Cy4.5 Confirming Method)

1 主题内容

镇定药和β-受体阻滞药咔唑心安在兽医处方中用于消除猪的紧张。特别是在转运至屠宰场的过程中防止猪死亡和掉膘而用药，从用药到屠宰一般不超过几个小时，这就可能导致在可食部分有这类药物高残留量。

在欧盟，许多镇定药和咔唑心安会在不同情况下使用。为了保证农场主在未经许可的情况下在产肉家畜中限制使用或者不用这些药物，可在屠宰场抽取肾脏样品，并用各种方法对此类化合物进行检测。不论何时，如出现阳性检测结果，都必须进行确证。按照残留指令(86/469/EEC)并采用本方法进行检测。

2 应用范围

本方法用于猪肾中6种镇定药和咔唑心安残留量的确证。镇定药和咔唑心安的鉴定限量为1-2.5μg/kg肾脏。氮哌酮形成的主要代谢物是氮哌醇，在残留量测定中需同时测定这两种化合物。

镇定药或咔唑心安的残留量表述为经所述方法测得肾中镇定药或咔唑心安的量，以μg/kg表示。

3 方法提要

本方法包括4个步骤

3.1 用乙醚提取经碱性匀浆的肾脏样品;

3.2 用硅基二醇柱净化;

3.3 用HPLC二极管阵列检测器分析和分级洗脱;

3.4 对选定的HPLC分离物用TLC进行镇定药和咔唑心安的确证。

4 试剂和材料

注1：除另有说明，化学试剂均为分析纯并来自Merck，水为去离子水或蒸馏水。

注2：本方法中采用了所列公司品牌的试剂，其它来源的符合要求的试剂也可等同使用。

4.1 化学试剂

4.1.1乙酸乙酯

4.1.2乙醇

4.1.3氯仿

4.1.4己烷

4.1.5 乙腈,HPLC级

4.1.6氢氧化钠

4.1.7 乙醚

4.1.8无水硫酸钠

4.1.9低沸点石油醚，沸程40-60℃

4.1.10浓硫酸

4.1.11乙酸铵

4.1.12 丙酮

4.1.13二氯甲烷

4.1.14 氨水

4.1.15硝酸铋（Ⅲ价）

4.1.16 冰乙酸

4.1.17 碘化钾

4.1.18香草醛

4.1.1985％磷酸溶液

4.2溶液

4.2.1乙腈+水（80+20,V/V）。

4.2.2乙腈+水（60+40,V/V）。

4.2.3乙腈+水（60+40,V/V）,含有0.1mol/L乙酸铵。

4.2.4乙腈+水+1mol/L乙酸铵（44.5+54.5+1，V/V/V）。

4.2.5薄层色谱（TLC）试剂。

4.2.

5.1展开剂Ⅰ；丙酮+二氯甲烷+25%氨水（40+60+1，V/V/V）。

4.2.

5.2 展开剂Ⅱ；丙酮+25%氨水（100+0.1，V/V）。

4.2.

5.3展开剂III；丙酮。

4.2.6 TLC显色剂

4.2.6.1Dragendorff试剂；0.8g 硝酸铋（Ⅲ价）溶于10mL冰乙酸和40mL蒸馏水中，8g碘化钾溶于20mL蒸馏水中，将两种溶液混合后储于暗处。配制工作试剂时将6mL上述溶液与12mL冰乙酸、100mL乙醇（96%，V/V）和100mL乙醚混合，用前现配。

4.2.6.2香草醛－磷酸试剂；将3g香草醛溶于100mL乙醇（96%，V/V）中，然后边搅拌边加入75mL 85%磷酸、50mL蒸馏水和50mL乙醚。

4.2.6.3 硫酸试剂：加20mL浓硫酸于100mL乙醇（96%，V/V）中，冷却后再加20mL 乙醚。

4.3标准物质：氮哌酮和氟哌啶醇(Janssen Pharmaceutica) ；乙酰丙嗪(Clin Midy) ；氯丙嗪(Sigma) ；丙酰丙嗪和甲苯噻嗪(Bayer)。

4.3.1组分Ⅰ是浓度为2μg/L的氮哌酮和氮哌醇氯仿溶液。

4.3.2组分Ⅱ是浓度为1μg/L的咔唑心安、氟哌啶醇和甲苯噻嗪氯仿溶液。

4.3.3 组分Ⅲ是浓度为1μg/L的乙酰丙嗪、丙酰丙嗪和氯丙嗪氯仿溶液。

4.4安全操作与注意事项

有机溶剂：所有的有机溶剂都必须作为潜在的有害物对待，使用时必须在通风橱中进行。

5 仪器设备

仪器设备所注明的生产公司和型号仅供参考，同类型性能相当的其它产品也适用。

5.1玻璃仪器

普通等级的小型实验室玻璃仪器

5.2仪器

5.2.1Ultra-Turrax均质器

5.2.2 Buchli带真空泵的旋转蒸发仪

5.2.3 95℃水浴

5.2.4 45℃水浴，具有氮气吹扫管以蒸发溶剂

5.2.5HAMILTON色谱用玻璃注射器

5.2.6 硅基二醇柱(Baker 70-9403)，提取前用3mL乙醇和3mL乙醚冲洗。

5.2.7 Baker 10 SPE系统

5.3 HPLC仪器

系统包括一个带有LKB 2152控制器的LKB2150泵，一个LKB 2212馏分收集器，一个Hewlett Packard 1040A二极管阵列检测器，一个作为反相前置柱的Chromguard置换柱(10mm×3mm i.d.)和一个填充SAS-Hypersil (5μm) (Shandon)的分析柱(150mm×4.6mm i.d.)，溶剂4.2.4作为流动相，流速为2mL/min。在235nm处检测洗脱物并分别收集3个洗脱馏分，第一组馏分包括氮哌酮和氮哌醇，第二组馏分包括咔唑心安、甲苯噻嗪和氟哌啶醇，第三组馏分包括乙酰丙嗪、丙酰丙嗪和氯丙嗪。

5.4 TLC装置，包括展开槽、喷雾器、点样器

5.4.1TLC色谱板，HPTLC-Fertigplatten Kieselgel-60型(Merck)。

5.4.2TLC色谱板用的70℃或120℃的烘箱。

6 样品和抽制样程序

依据欧盟兽药残留量分析方法对样品和抽制样程序的要求，遵照国际标准化组织文本[ISO 78/2-1982(E)]和欧盟指令（2052/Ⅵ/84-EN）附录Ⅱ的有关规定列出技术要求如下：6.1样品的性状：肾脏样品应该能够进行残留量的检测。

6.2样品量：样品量应能满足按此方法进行检验并在必要时进行重复分析的需要。

6.3肾脏样品在抽取后必须马上冷冻保存，在分析前的保存温度必须≤-20℃。

7 测定步骤

7.1解冻肾脏样品，去掉髓质。