流式细胞术

BrdUrd Incorporation
– Bromodeoxyuridine (BrdU) 是一个胸腺 核苷的类似物
– 能够在细胞增殖和细胞周期状态分析中 起作用
– BrdU能与正在复制周期内的细胞相结合 – 使用BrdU抗体能够检测到BrdU
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2M
0
200
400
600
800
1000ห้องสมุดไป่ตู้
2N
4N
DNA content
# of Events
A typical DNA Histogram G0-G1 G2-M S
Fluorescence Intensity
•红色为正常二倍体细胞；黄色为异倍体细胞
1. 用未染色细胞调整仪器PMT电压 2. 用单染色的细胞调节仪器补偿
关于同型对照
例：一个双色染色的实验 抗体A FITC，抗体B PE 对应的同型对照是IgG1 FITC, IgG1 PE
那么需要准备的是 阴性对照：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE 单阳性对照：
FITC: 细胞加上Ab A FITC, IgG1 PE PE: 细胞加上Ab B PE, IgG1 FITC
增殖相关基因
PCNA(Proliferating cell nuclear antigen) 一种蛋白质，在DNA复制和核苷酸的切除
修复中起到作用 Ki-67 - proliferation related antigen Ki-S1 - proliferation related antigen Phospho-histone Cyclin D1, E, A, B1
流式细胞仪系统
通过流式细胞仪我们可以得到以下信息 - 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度
Fluorescence signals
Focused laser beam
Injector Tip
Sheath fluid
流式细胞仪的光信号
散射光信号 荧光信号
Nucleic acid Probes
菲啶基 Propidium Iodide Ethidium Bromide
苯甲亚胺 Hoechst 33342
抗生素 Mithramycin, Chromamycin A3
Acridine Orange – AO （吖啶） Pyronyn Y
Normal Cell Cycle
Computes Height for each pulse Calculates width and area Interfaces with the computer for data transfer
Creation of a Voltage Pulse - Analog Signal
Flow Cytometry
in clinics and research
What can Flow Cytometer tell us about a cell?
Cytokine/Chemokine
Migration/
Production Repertoire
Homing Phenotypre
流式细胞仪的科研应用
免疫功能研究 细胞动力学功能研究 动物性别筛选 海洋与环境微生物分析 染色体分选
流式细胞仪的遗传学应用
细胞DNA, RNA 含量的测定 染色体倍体分析 染色体分离 基因表达产物的生物活性研究 基因转染表达的生物效应 基因表达调控研究 细胞内基因定位 酵母转基因株的筛选 报告基因的定性定量检测 植物遗传学研究 ••••••
Specific signal: weak
Nonspecific binding: low
间接染色
Fluorescent probe attached to a 2nd antibody
Specific signal: strong, 5-6 2nd Ab/each 1st Ab;
Nonspecific binding: high
Ab B
双色荧光散点图
现代流式细胞仪包括
液流系统
聚焦细胞以供检测
光学系统
激发和收集光信号
电子系统
将光信号转化为电信号，并使其数字化以供 计算机分析
液流系统
液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处
Sample Flow in Optical Cuvette
Low Sample Flow Rate
Avidin-Biotin method I
biotinylated primary Ab
biotin avidin卵白素
biotinylated dye
生物素(酰)化
示意图
步骤三： 数据收集和分析
画图 寻找目标细胞 调整仪器设置到合适的状态 我们可以得到怎样的结果？它们意味着
什么？
仪器设置调节
Cytokine/Chemokine Receptor Repertoire
Cell Lineage/Subset Phenotype
Cell cycle status
细胞增殖（细胞周期）
细胞内DNA含量 增殖相关基因的表达 BrdU的结合 示踪染料
DNA 探针
DNA探针最主要的特点是，它们与DNA 含量是成化学正比关系的——这样，带有 的探针荧光分子的数目就和DNA分子的 含量相当，从而检测DNA含量
Lasers Lenses and mirrors that route the laser light to
the fluidic stream
• Collection optics consist of:
Filters that direct the signals to the appropriate optical detectors
Freq
Two-Color Cell Analysis
Which of the three populations has the most Ab A binding sites?
Ab A This is a dot plot of Red vs. Far Red data for cells that have been stained with antibodies conjugated to fluorochromes
GFP PI PerCP-CY5.5
Detector Parameter FL1 FL2
FL3 FL4
Filter
530/30 585/42 670LP 661/16
Electronics
Converts analog signals to proportional digital signals
实体组织：
病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本 针吸组织：新鲜样本
鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质
步骤一：
选择合适的荧光染料
必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激 发
激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合 适范围内
荧光素光谱的重叠应当尽量减少
荧光产生过程
Propidium Iodide碘化丙啶
RNA含量
酶活性
蛋白质含量
激素结合位点
染色体分析
细胞受体
细胞凋亡
在上述信号基础上的细胞分选
流式细胞仪的临床应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 血小板功能及相关疾病
Voltage
Laser Laser Laser
Voltage
Voltage
Time Time Time
Quantification of a Voltage Pulse
Height is a measurement for all parameters.
Width = Area/Height
700 nm
Protein
Allophycocyanin (APC)别藻蓝蛋白
Protein
632.5 nm (HeNe)
300 nm 400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Excitation Emisson
步骤二： 染色
体积 温度 孵育时间 对照
直接染色
Fluorescent probe attached to antibody
Pulse Area
0 Pulse
Width Time
Volts
Pulse Height
样本处理
细胞悬液的制备
细胞悬液：
分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致 细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差
直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便， 样本用血量小
灌洗液、体腔积液 培养细胞、细胞系
Optical Filters
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP500/50
FACSCalibur光路图
Optics
Laser
488 nm
635 nm
Fluorochromes
FITC PE PerCP APC
12 mL/min
Optical Cuvette
Laminar Flow
High Sample Flow Rate
60 mL/min
Laminar Flow
Sheath
Sheath
Sample
Sheath
Sheath
Sample
Optics
• Excitation optics consist of:
2. 荧光信号
荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子
荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧
光信号越强
荧光检测器
FALS Sensor
Fluorescence
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
数据分析
设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，
平均荧光值，绝对数或抗体结合数
如何设定阴性与阳性的界限
直方图
散点图
流式细胞术的细胞学应用
细胞结构
细胞功能
细胞大小
细胞表面/胞浆/核的特
细胞表面面积
异性抗原
核浆比例
细胞活性
DNA含量与细胞周期 细胞内细胞因子
流式细胞术
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可 以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常 是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加 以分选
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、 及人工合成微球等
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以 定量
1. 散射光信号
前向角散射光（FSC,Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信号,测定细胞 相对大小及其表面积。
Laser
FALS Sensor
侧向角散射（SSC, Side Scatter）
入射激光90角的散射光信号，测定细胞粒度及细胞 内相对复杂性。
Laser
FALS Sensor
Excitation
300 nm 400 nm
500 nm
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Relat iv e I nt ens it y
DNA
PI
Fluorescein (FITC)
300 nm
Excitation Emisson
400 nm
500 nm
Wavelength
600 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
700 nm
Relat iv e I nt ens it y
Protein
Phycoerytherin (PE)藻红蛋白
Excitation Emisson
300 nm 400 nm
500 nm
600 nm
90LS Sensor
散射光
散射光能被用来区分不同细胞群体的基本 形态上的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒 的数据
散点图——Dot Plot
lysed whole blood
Question
Dead cells are known to be smaller and to exhibit more internal complexity than live cells. Which of the populations on this plot would you expect to be dead?