手工克隆小鼠胚胎的研究

体。
打开融合仪（ BLS CF － 150 / B） ，调节电
培养液： CZB，配制参考［11］。mPZM， 压及 脉 冲 间 隔。 设 计 三 组 参 数， Ⅰ 为 DC
配制参考［12］。
130 V，83 μs； Ⅱ为 DC 43 V，80 μs； Ⅲ为
体细胞培养液及细胞消化液： 商品化高 DC 80 V，40 μs。在融合盘中，将一枚去核
人员去核操作。在以后实验中，CBMP 均采 作为 IVC 培养液可获得比较高的囊胚率，故
用 10 μg / mL Pronase 浓度配制。
实验选用 CZB 作为 IVC 液。
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黑龙江动物繁殖 第 22 卷 第 6 期 2014 年
表 4 不同培养液对胚胎发育的比较
化学 激 活 亦 是 核 移 植 中 不 可 缺 少 的 步
摘 要： 与传统克隆相比，手工克隆使用较为简单的仪器设备和技术操作即可生产克隆动物。 小鼠作为模式实验动物在多领域得以应用。本研究中采用杂交胎鼠细胞系提供核供体细胞，在 含细胞松弛素 （ Cytochalasin B，CB） 和链蛋白酶 （ Pronase） 及 2% 血清的 M199 hepes 缓冲液滴 （ CBMP） 中消化透明带并切割去核，电融合后 1 h，重构胚置于含 SrCl2 及 CB（ 5 μg / mL） 的无钙 体外培养液（ Ca2 + － free IVC） 中激活 6 h，体外培养液（ IVC） 中清洗 3 遍后，移入 WOW 系统培 养，培养至小鼠 HMC 囊胚阶段。研究发现： 1） CBMP 液中 Pronase 的浓度相比 20 μg / mL 和 100 μg / mL，卵母细胞透明带在 10 μg / mL 组需要更长时间消化至消失，较有利于操作； 2） 直流电 （ DC） 80 V，持续 40 μs，融合率达 60% 。3） 含 10 mmol / L SrCl2 的化学激活液处理的重构胚与 5 mmol / L 组相比，囊胚更高 （ 29 ± 3% ∶ 13 ± 3% ，P ＜ 0. 05 ） ，差异显著； 4 ） 两 种 体 外 培 养 液， CZB 与 mPZM，在 IVC 囊胚率上无显著差异（ 29 ± 3% ∶ 24 ± 5% ，P ＞ 0. 05） ，而使用 CZB 可获得 较高的囊胚率。
小鼠由于具有遗传背景清楚，繁殖周期 短，饲养成本较低，材料比较容易得到等优 点，成为一种广泛使用的模式实验动物［7，8］。 第一只成纤维细胞克隆小鼠，由 Wakayama 等人在 1998 年获得［9］。研究人员通过显微 操作直接将供体细胞注入去核卵母细胞，成 功得到了来自颗粒细胞作为供体核的正常后 代，以及支持细胞和神经细胞作为供体核的
2. 3 不同氯化锶浓度的化学激活液对激活 效果的影响
实验对添加两种不同浓度氯化锶的化学 激活液进行了比较，结果可见表 3，两组间 差异显著。经过添加 10 mmol / L Srcl2 的激活 液处理的重构胚，可以得到更多的囊胚。
表 3 不同氯化锶浓度对激活效果的比较
间的影响 统一脱去卵丘细胞的卵母细胞，15 个卵
培养液 重构胚 /个 囊胚 /个 平均囊胚率 /% 骤。本实验 对 比 了 在 无 钙 离 子 CZB 中 添 加
CZB
96
27
29 ± 3a
CB 及不同浓度氯化锶作为激活液，结果表
Pronase 浓度 μg / mL 10 20 100
卵母细胞 /个 90 90 90
平均消化透明 带用时 / min 2. 73 ± 0. 06a 1. 37 ± 0. 05b 0. 79 ± 0. 04c
注： 同一列表中上标不同表示差异显著（ P ＜ 0. 05） ，所标 字母相同表示差异不显著（ P ＞ 0. 05） ，下表同。
用口吸管将切割盘里 M2 滴中卵母细胞
卵子采集液： M2，参考［11］配制。
一次转移 10 ～ 15 枚至 20μL CBMP 滴中，观
去Βιβλιοθήκη Baidu液： 为含有 5 μg / mL 细胞松弛素和 察透明胞质中细胞核的位置，待透明带变薄
10 μg / mL，20 μg / mL，或 100 μg / mL 链 蛋 变软时，用特殊 HMC 刀片将含有核的胞质
质产生融合，成功获得小鼠尾尖细胞克隆小 （ Trypsin） 。 鼠［9］。Ｒ． Ｒibas 等人，在 2005 年发表的文 1. 4 卵母细胞采集
章中，阐述了以钝头去核针和顶端封闭的分
室温条件下，7 ～ 8 周龄的 KM 雌鼠，每
离管结合使用，去除无透明带卵母细胞细胞 只空腹腔注射 10IU 的 PMSG，48 h 后腹腔注
从培 养 箱 中 取 出 重 构 胚， 在 无 钙 离 子 CZB 液中清洗 3 遍，移入含有 Srcl2 （ 5 mmol / L 或 10 mmol / L） 及 CB（ 5 μg / mL） 的化学激活 孔中，置于 CO2 培养箱，37 ℃ ，放置 6 h。 1. 9 重构胚培养
重构胚无透明带，故采用 WOW 培养系 统。将化学激活后的重构胚，在 CZB 液中清
糖 DMEM 液加入 1% 谷氨酰胺（ GLU） ，非必 胞质与一枚核供体细胞用植物凝集素（ PHA）
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粘合后，置于 PFM 液滴中平衡，与另一枚去
表 1 不同 Pronase 浓度消化透明带时间比较
试剂的研究，初步建立了一套适合本实验室 放入含有透明质酸酶（ Hya） 的 M2 滴中，卵
运用的手工克隆技术及在体外条件下生产小 丘细胞脱落后的卵母细胞在 M2 中洗涤 3 遍，
鼠胚胎 的 实 验 流 程，为 转 基 因、胚 胎 干 细 转移至切割盘里的 M2 滴中。
胞、模式动物克隆等研究提供材料。
1. 5 核供体细胞准备
1 材料与方法
核供体细胞系来自 12. 5 d 的 CF － C 胎
1. 1 试剂
鼠，由 CF － 1 ♂与 C57 ♀杂交得到，来自本
孕马血清促性腺激素（ PMSG） ，人绒毛 实验室。在进行克隆实验之前 1 h，选择 24
膜促性腺激素（ hCG） 购自宁波制药二厂。其 孔板中培养核供体细胞生长至汇合率达 90%
余试剂购自 Sigma 公司。
培养孔，用 0. 05% 胰蛋白酶（ Trysin） 消化细
1. 2 实验动物
胞，完全培养基终止消化，移液器轻微吹打
KM 品系鼠，C57 品系鼠和 CF － 1 品系 后，液体转移到 EP 管中。
鼠均采购自广东省医学实验动物中心。
1. 6 卵母细胞去核
1. 3 溶液配制
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正常胎儿［9］。Atsuo Ogura 等人，通过电融合 需氨基酸（ NEAA） ，15% 胎牛血清（ FBS） 配
法，将供体细胞核注入卵周隙，加以一定强 制成完 全 DMEM 细 胞 培 养 液。商 品 化 PBS
度电脉冲，使供体细胞核与去核卵母细胞胞 粉末配制 D － PBS。商品化 0. 05% 胰蛋白酶
母细胞为一组，放入含不同 Pronase 浓度的
Srcl2 （ mmol / L） 重构胚 / 个
5
93
10
96
囊胚 /个 12 27
平均囊胚率 /% 13 ± 3a 29 ± 3b
CBMP 液滴中消化透明带并进行去核。由表 2. 4 不同培养液对胚胎发育的影响
1 可见，三个浓度组别间差异显著。10 μg /
本实验首次采用 HMC 方法体外条件下生产小鼠克隆胚胎，通过摸索透明带消化时间、电 激活参数、化学激活试剂及培养液，尝试小鼠体外生产克隆胚胎的新方法，并取得了初步成 果，技术优化及效率提高问题仍需要更进一步的研究。 关键词： 小鼠； HMC； 透明带消化； 电融合； 化学激活； 体外培养 中图分类号： S814. 3 文献标识码： A 文章编号： 1005 － 2739（ 2014） 06 － 0011 － 05
2004 年，Vajta 等人，利用手工克隆方 法成功获得了克隆牛［3］。此方法是在体视显 微镜下，手持特制刀片将无透明带卵母细胞
收稿日期： 2014 － 09 － 15 作者简介： 陈玉 （ 1981 － ） ，女，硕士，助理研究员。
的核切除，从而达到去核目的。手工克隆与 传统克隆相比，无需使用显微操作仪，仅使 用较简单的仪器设备和技术要求即可生产克 隆动物。至今，通过手工克隆技术，已经生 产出了猪［4］、基因猪［5］、转基因绵羊［6］等哺 乳动物。
在其他操作相同的情况下，比较了两种
mL 组相比其它两个浓度组，卵母细胞可在 培养液对小鼠 HMC 重构胚体外发育的影响。
10 μg / mL 组 液 滴 中 存 放 更 长 时 间 （ 2. 73 ± 结果如表 4 所示，两者在 IVC 囊胚率上无显
0. 06 min） 透明带才会完全消失，方便实验 著差异（ P ＞ 0. 05） 。平均囊胚率显示，CZB
核，经电融合构建重构胚，继而获得克隆小 射 10IU hCG。在注射 hCG 13 h 后，采用断
鼠的实验［10］。
颈椎法处死小鼠，并且剪下输卵管连接卵巢
研究人员通过对卵母细胞透明带消化试 段，转移至显微镜下，挑破输卵管膨大部，
剂、电激活参数、化学激活时间，以及培养 收集卵丘卵母细胞复合体（ COCs） 。将 COCs
2. 2 不同电融合参数对融合率的影响 实验采用 3 组电融合参数对用 PHA 粘合
后的重构体进行电融合，结果如表 2 所示， 只有Ⅲ（ DC 80 V，40 μs） 出现了融合，其余 两组重 构 体 在 电 击 时 或 是 电 击 后 细 胞 质 弥 散，死亡。故电融合时，电融合仪器设置为 DC 80 V，40 μs。
白酶（ pronase） 的 M2，即 CBMP。
部分切除，转移去核后细胞质到 M2 滴中存
电融合液： PFM，参考［4］配制。
放。循环此动作至所有卵母细胞全部完成去
化学激活液： 含 5 mmol / L 或 10 mmol / L 核。
氯化锶（ SrCl2 ） 和 5 μg / mL CB 的无钙 CZB 液 1. 7 电融合过程
核胞质配对，再移入盛有融合液的融合槽电 极之间（ 电极之间宽 650 μm） ，用玻璃针轻 拨，通过电流作用使重构体（ 去核胞质 － 核 供体细胞 － 去核胞质） 方向和电流方向垂直， 最后开启电击。一次电击 5 套重构体，循环 操作 至 所 有 配 对 重 构 体 电 融 合 完 成。 电 击 后，用玻璃针轻柔取下重构体，移入 M2 滴 中。将融合后的重构胚置 于 CZB 液 中，于 CO2 培养箱，37 ℃ 中放置 1 h。 1. 8 化学激活
表 2 不同电融合参数比较
参数组别 Ⅰ Ⅱ
重构体 /套 10 10
融合 /个 0 0
融合率 /% 0a 0a
洗 3 遍， 逐 个 移 入 盛 有 CZB 或 mPZM 的
Ⅲ
20
12
60 b
WOW 孔中，置于 CO2 培养箱，37 ℃ ，培养 至第 4 天，可观察囊胚发育情况。 1. 10 统计分析
所有试验组至少重复 3 次，所得试验数 据均用方差分析统计，确定差异的显著性。 2 结果 2. 1 去核液中 Pronase 浓度对消化透明带时
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手工克隆小鼠胚胎的研究
陈 玉1，2 ，李 杏1 ，张海平1 ，Gábor Vajta1，2 ，陈文彬1 ，刘 杰1 ，李 林1 ，杜玉涛1，2
（ 1. 深圳华大方舟生物技术有限公司，广东 深圳 518083； 2. 深圳华大基因研究院，广东 深圳 518083）
众所周知，1997 年首次获得的体细胞克 隆绵羊［1］是在显微操作仪器辅助下，通过显 微操作技术（ 传统克隆） 把供体核移入去除遗 传物 质 的 成 熟 卵 母 细 胞 中， 新 移 入 的 细 胞 核，发生发育重编程过程，形成重构胚。在 获得克隆绵羊之后，黄牛、水牛、山羊、骡 子、马、猪、小鼠、大鼠、兔子、猫、狗等 多种克 隆 动 物 均 通 过 显 微 操 作 技 术 相 继 问 世［2］。