石蜡切片制作过程

（一）材料与用具
1．材料：鱼皮肤、性腺、肠、肝胰脏等。

2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。

（二）实验内容与步骤
1．取材及固定
取动物体上的小块组织成为组织块。

组织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜。

切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。

组织块取下后，先用先用0.85％的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。

由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。

如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。

材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定，以保持其原有的结构。

不同的组织应选用适当的固定液。

固定液的用量与组织块体积之比一般在20：1。

不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。

2．冲洗
固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。

组织块应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗24小时。

AFA固定液则不需要水洗。

3．脱水和硬化
经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。

常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。

脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。

脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。

脱水所用的酒精浓度及过程如下：
30％—→50％—→70％—→80％—→90％—→95％—→100％(Ⅰ)—→100％(Ⅱ)
组织块在各级较低浓酒精（小于70％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过0.5立方厘米的组织块脱水时间为6～12小时，在高浓度酒精中（大于70％）脱水时间为3小时左右。

组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。

由于无水酒精有使组织变脆的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15～30分钟左右。

在脱水瓶中酒精的量与组织块之比约为50：1。

简化步骤如下：
70%（一夜）——80%（1小时）——90%（30分）——95%（30分）——100%（15分）——酒精+ 二甲苯（15分）——二甲苯（3分）——石蜡+ 二甲苯（30分）——石蜡（80分）
4．透明
透明是石蜡切片法切片前必经的一步。

其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒精，以便于熔化的石蜡浸渗到组织间隙中，故透明剂必须是能分别与石蜡和酒精相溶的。

经过透明剂处理的组织块用肉眼对光观察呈透明现象，所以这个过程称为透明。

常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯等，这些都是穿透力强易使组织变脆的透明剂，因此透明的时间宜短，一般在20分钟即可。

透明时组织块由无水酒精中取出，先放入二甲苯和无水酒精等量混合的溶剂中1小时左右，然后取出放入纯二甲苯中20分钟即可。

5．浸渗
浸渗过程是使包埋组织用的物质深入到所有的组织间隙中，然后再通过各种方法使这种物质凝固，而将组织材料包埋其中。

石蜡切片法和火棉胶切片法都需要浸渗过程。

石蜡切片法是将加热的石蜡渗到组织中而火棉胶切片法是使火棉胶渗到组织间隙中去。

在浸渗前要先将选好的石蜡分别以容器装好放在恒温箱中，使其杂质沉淀。

石蜡最好选用软蜡和硬蜡两种，软蜡熔点为45～50℃之间，硬蜡熔点为56～58℃之间，60～62℃的硬蜡很少用。

冬天室温较低时多用软蜡，夏天室温较高时多用硬蜡。

浸渗应在自动恒温箱中进行。

组织块在各个蜡杯中浸蜡的时间如下：
软蜡1 30min
软蜡2 30min
硬蜡1 30～60min
硬蜡2 60～120min
这一时间不是固定不变的，应视组织块的种类及大小而相应延长或缩短浸蜡时间。

浸蜡的总时间一般为：0.5立方厘米的组织块时间为6～8小时；0.2～0.3立方厘米的组织块时间为3～5小时；0.1～0.2立方厘米的组织块时间为2～3小时。

当发现蜡杯中有灰尘或组织碎块时应使其沉淀或过滤后再使用。

浸蜡不透包埋后会出现白色不透明部分，此时需要在浸蜡一次。

6．包埋
包埋就是将已经浸渗好的组织块包埋于浸渗剂中，石蜡包埋法如下。

浸蜡终了时，将预先预热好的和第四杯石蜡相同熔点的石蜡倒入折好的蜡槽内，然后从第四个蜡杯中取出组织块，放入蜡槽内，摆好位置，注意组织切面的摆放方向。

放好组织后可以自然冷却，也可以放入冷水中直接冷却。

7．塑型和切片
取已经包埋好的蜡块，将纸盒拆下，用加热的刀片或解剖刀将其分成若干块（每块组织占一块），用解剖刀将组织块周围多余的石蜡切去，注意不要切到组织。

把有组织的蜡块修成正方形或梯形。

在进行塑型时一定要注意组织块切面的方向。

蜡块塑好后将其粘在小木块上。

注意要粘牢。

最后在木块侧面用铅笔记上组织块名称、编号。

切片时采用手摇连续切片机。

使用切片机进行切片时，将蜡块固定在切片机上，调好距离和所要求的切片厚度，然后用右手摇动手柄，即可进行切片了。

一般来讲生物切片的厚度在5～10微米。

对于切下的切片不要用手去取，因为体温可以使蜡片粘到手上，正确的做法是用毛笔或牙签挑取，然后放在载玻片上进行展片和粘片。

8．展片和粘片
切下的组织蜡片往往带有皱褶，所以在染色前必须进行蜡片的展片和粘片，即把切好的蜡片平整的粘在载玻片上。

展片的温度因石蜡熔点的不同而的不同，一般的56～58℃的石蜡切片℃的温水进行展片，48～52℃的石蜡切片用35℃的温水进行展片。

等到蜡片充分展平后，取一清洁载玻片，载玻片上涂一薄层蛋白甘油，然后在水中捞取蜡片，捞完后将蜡片摆正，放到格盘内，置38℃温箱中烘干，然后即可进行染色。

展片和粘片比较简单容易做，但是如果处理不好则无法进行染色，即使能染上色，组织切片内部的结构也往往被破坏。

9．染色和封固
为了观察组织内部的细微结构，必须应用某些与固定后的原生质有亲合性的染料，对组织进行染色，否则有碍观察。

普通的染色法有两种即苏木紫伊红染色法（简写为H?E）染色结果是细胞核为紫色，细胞质为粉红色；另一种方法为铁苏木紫染色（简写为I?A），染色的结果是全部着以深浅不同的蓝色。

苏木紫伊红染色法整个染色过程如下：
取已经干燥的切片，放于盛有二甲苯的染缸内脱蜡10min左右，这个过程称为脱蜡。

脱完蜡后的切片即可进行染色，具体染色过程和时间如下：
（1）100％酒精洗去二甲苯2～5min。

（2）95％酒精2～5min。

（3）90％酒精2～5min。

（4）80％酒精2～5min。

（5）70％酒精2～5min。

（6）50％酒精2～5min。

（7）蒸馏水洗2～5min。

（8）苏木紫染液10～20min。

（9）普通水洗1min。

（10）盐酸酒精分色数秒～半分钟（70％酒精100ml＋盐酸1ml），分色到切片为带粉红色后立即取出。

（11）自来水冲洗数小时。

镜检切片呈清朗的蓝色，细胞核非常明显。

（12）蒸馏水洗1min。

（13）50％酒精2～5min。

（14）70％酒精2～5min。

（15）80％酒精2～5min。

（16）伊红酒精溶液对比染色2～5min（95％酒精＋0.5g伊红）。

（17）95％酒精2～5min。

（18）无水酒精Ⅰ3min。

（19）无水酒精Ⅱ3min。

（20）无水酒精加等量二甲苯2min。

（21）二甲苯数分钟到透明为止。

（22）自二甲苯中取出切片，放在格板内，滴少量的树胶于组织片中央。

（23）取一盖玻片，轻轻以盖玻片的一边接近载玻片，然后迅速放下盖玻片，树胶即迅速扩张到四周，校正好盖玻片方向。

将封好的切片放置在恒温箱中干燥。

最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染色方法、固定方法、年月日。

（三）药品的配制
1．配制各级浓度的酒精(见下表)
所用酒精浓度
欲配酒精浓度
95％90％85％80％75％70％65％60％55％50％
90％ 6.5
85％13.36 6.56
80％20.1 13.79 6.86
75％29.66 21.89 14.48 7.20
70％39.16 31.05 23.14 15.35 7.64
65％50.66 41.53 33.03 24.66 16.37 8.15
60％63.16 53.65 44.48 35.44 26.47 17.58 8.76
55％78.36 67.87 57.90 48.07 38.32 28.63 19.02 9.47
50％96.13 84.71 73.90 63.04 52.43 41.73 31.25 20.47 10.35
45％46.09 34.46 22.90 11.41
40％
35％
30％
2．配制各种固定液
常用的固定液为波恩氏（Bouin’s）固定液。

配制方法如下：
苦味酸饱和水溶液75ml
甲醛25ml
冰醋酸5ml
3．蛋白胶亦称梅氏蛋白的制作
将鸡蛋一个打破让蛋清流入烧杯内，用筷子充分条大雪花状泡沫，然后将它用双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，过滤出透明的蛋白液，此时再加入等量的甘油，稍稍振摇使两者混合，最后加入麝香草酚（thymol）（1：100）做防腐作用，可保存几个月到一年。

4．洗液的配制
（四）载玻片和盖玻片的清洗方法
新载玻片的洗涤可分别将载玻片逐片投入到洗液中浸泡数小时，取出后先用自来水冲洗干净洗液，然后再用蒸馏水清洗两遍，最后投入95％酒精中备用，用时取出在玻片用干净的纱布擦干即可。

陈旧的切片标本，如再用其载玻片，可将其浸泡在肥皂水中煮30min左右，然后在热水中洗去残留的树胶及浆糊等，用清水冲洗干净放入洗液中浸1h，然后自来水冲洗干净洗液，再用蒸馏水清洗两遍，最后投入95％酒精中备用。