犬瘟热病毒截短P蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

犬瘟热病毒截短P蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

袁维峰;贾红;于萍萍;侯绍华;郭晓宇;史利军;赵占中;朱鸿飞

【摘要】为制备针对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV) P1蛋白的单克隆抗体(McAb),本研究利用重组犬瘟热病毒P1蛋白免疫BALB/c小鼠,并将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,用CDV包被ELISA板,通过间接ELISA法筛选出两株稳定分泌抗CDV-P1的杂交瘤细胞株(E9E4C10、E9F8D9).间接ELISA检测腹水效价均为1∶106,亚类鉴定结果均为IgG2b.Western blotting和间接免疫荧光(IFA)分析结果表明,两株单克隆抗体均能与重组P1蛋白和CDV发生反应；ELISA叠加试验增殖结果表明,两株单克隆抗体识别的抗原表位不同.本研究制备的特异性抗CDV-P1的单克隆抗体为建立CDV免疫学检测方法和P蛋白的功能研究奠定了基础.%The assay was aimed to prepare monoclonal antibodies (McAbs) against P1 protein of canine distemper virus (CDV). BALB/c mice were immunized with P1 protein and the immunized mice spleen myeloma cells were fused with SP2/0. Two hybridoma cell lines of E9E4C10 and E9F8D9 that stably produced antibodies against protein were identified by ELISA. The antibody titres of ascites for the hybridoma lines were both 1:106. The subtypes of monoclonal antibodies were both identified as IgG2b. Western blotting and IFA showed that the McAbs specifically recognized certain antigenic epitopes of P1 protein of CDV. Additive index of ELISA competitive binding assay indicated that the two monoclonal antibodies were specific for different epitopes. The McAbs prepared in this study were useful tools for developing immunological diagnosis techniques of CDV and investing P protein function.

【期刊名称】《中国畜牧兽医》

【年(卷),期】2013(040)004

【总页数】4页(P22-25)

【关键词】犬瘟热病毒;重组P蛋白;单克隆抗体;鉴定

【作者】袁维峰;贾红;于萍萍;侯绍华;郭晓宇;史利军;赵占中;朱鸿飞

【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;山东农业大学动物科技学院,山东泰安271017;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193

【正文语种】中文

【中图分类】S852.65+_5

犬瘟热（canine distemper，CD）是由犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）感染犬或其他食肉目动物所引起的急性、高度接触性传染病，临床上以双向热、红疹、结膜炎及中枢神经系统损害为主要特征。近年来，随着中国军犬、警犬、试验用犬和宠物犬饲养量的大幅度增加，该病在中国犬中的发病率和死亡率均有升高的趋势，且CDV的宿主谱有不断扩大的趋势，陆续出现了大熊猫、猕猴等珍贵动物感染CDV的报道（何洪彬等，2001）。Mee等（1993）从患Paget病（Paget’s disease）的病人组织中检测出了CDV的核酸，从而使该病受到广泛

CDV属副黏病毒科麻疹病毒属成员，为不分节段的单股负链RNA病毒，其基因

组共编码核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、大蛋白（L）、融合蛋白（F）和血凝蛋白（H）6个结构蛋白。P蛋白由1655个核糖核苷酸组成，位于基因组的1742－3396核苷酸处，包含2个部分重叠的阅读框架，编码3种蛋白，即结构蛋白P、非结构蛋白V和C。P蛋白是CDV结构蛋白中第2大蛋白，

较为保守，与RNA的转录和复制有关，具有聚合酶的功能，在接种病毒12 h后

可以检测出为磷酸化的P蛋白，是出现早且持续存在的蛋白。目前，犬瘟热单抗

的研究主要集中在治疗性单抗，如针对H及F蛋白的单抗（陈万荣等，2002；苏建青等，2009），由于P蛋白在该病毒谱系中极为保守，因此，P基因在进行系

统发育分析时就显得特别重要，将其作为诊断抗原或制备诊断抗体具有可行性（贾红玲等，2008）。制备针对犬瘟热P蛋白的单克隆抗体（McAb）对研究该蛋白

质的生物学特性和建立犬瘟热的检测方法具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物、细胞、菌株和病毒 8～12周龄SPF级BALB/c小鼠购自芳缘养殖公司；SP2/0骨髓瘤细胞由农业部结核病和宠物疫病诊断实验室保存；CDV P1蛋白基因工程重组菌株由农业部结核病和宠物疫病诊断实验室构建保存；犬瘟热疫苗变异株由农业部结核病和宠物疫病诊断实验室分离保存。

1.1.2 试剂 HRP标记的羊抗鼠IgG抗体、FITC羊抗鼠IgG均购自中杉金桥生物技术有限公司；HRP－DAB底物显色液购自天根生物技术公司；RIPA裂解液购自华特生公司；弗氏佐剂、抗体亚类鉴定试剂盒、HT和HAT购自Sigma公司；DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自四季青公司；蛋白G抗体纯化柱

购自Pierce公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。