植物NADP+ -依赖型异柠檬酸脱氢酶的分子进化及功能研究进展

同一个基冈编码，但至今植物中一个基因是如何编码 两种ＩＣＤＨ同Ｔ酶以及植物调节ＩＣＤＨ在细胞内分布
的机制尚未弄清楚。
从１９９２年第一条紫花苜蓿ＩＣＤＨ编码序列被测定
以来，不同植物的ＩＣＤＨ序列陆续被测定。经ＮＣＢＩ网 站上ＢＬｉｎｋ程序的统计，目前共有２１种绿色植物的
４６条序列与烟草ｃｙｔＩＣＤＨ（登录号Ｐ５０２１８）相匹配。 由氨基酸序列比对得出，ＩＣＤＨ在进化过程中高度保
摘要：高等植物ＮＡＤＰ依赖型异柠檬酸脱氢酶（ＩＣＤＨｓ）定位于细胞质、线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等植物细
胞的不同部位，由不同的基因编码，属于一个高度保守的多同工酶蛋白家族。对近年来关于植物ＮＡＤＰ＋椎赖型
异柠檬酸脱氢酶的分子进化及功能研究进行综述，同时提出了未来植物ＩＣＤＨｓ的研究重点和方向。最新的分子
低，而且与底物结合的Ｋｍ值相对比较高。反之，ＩＣＤＨ
与底物结合的Ｋｍ值较低，更容易与异柠檬酸结合，发
生催化反应。氨的同化主要发生在质体中，尽管在植
物细胞的质体中存在有ＩＣＤＨ，但其活性很低，不能提
供足够的ａ．酮戊二酸供谷氨酸合成酶（ＧＯＧＡＴ）同化
氨的需要。因此提出了植物ｃｙｔｌＣＤＨ是催化产生仅．酮
生物学杂志 ＪＯＵＲＮ ＡＩ．ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ
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檬酸合酶）的变化相一致。他们认为日夜交替时细胞 需要更多的碳骨架去吸收和同化白天积累的氨和谷氨 酰胺，此时ｃｙｔｌＣＤＨ转录水平的增加以及细胞总ＩＣＤＨ 活力的提高说明ＩＣＤＨ是参与形成氨的同化所需碳骨 架的主要酶之一。
省引进海外留学人才基金（２００５２０３２）
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万方数据
第２６卷第３期 ２００９年６月
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受到Ｓｅｒ残基可逆磷酸化的调控，当Ｓｅｒ被磷酸化时， ＥｃｌＤＨ失活，反之则被激活。虽然植物ＩＣＤＨ拥有相 应的Ｓｅｒ残基，但到目前为止还没有足够的证据证明
戊二酸供氨基酸合成的主要酶的观点。
Ｓｃｈｅｉｂｌｅ等人测定了烟草细胞中与氮代谢相关的
酶活力和编码基因的转录水平在一天内的变化，ｃ”一
ＩＣＤＨ编码基因的转录水平以及细胞中总ＩＣＤＨ的活
力在日夜交替的时候表现出最高的水平，这和在碳通
路中参与形成０【一酮戊二酸的两个酶（丙酮酸激酶和柠
万方数据
第２６卷第３期 ２００９年６月
系统学分析显示，植物中不同细胞定位的ＩＣＤＨ同工酶聚在各自相应的进化枝上，动物或植物中不同细胞器的
ＩＣＤＨ同工酶均来源于各自祖先ＩＣＤＨ基因的独立倍增。最新的功能研究表明，ＩＣＤＨｓ催化合成的ｄ－酮戊二酸可
为植物细胞对氨的吸收同化提供碳骨架。而ＮＡＤＰＨ可以维系细胞内的氧化还原平衡，帮助植物抵御氧化胁迫。
依据细胞内的定位，植物ＩＣＤＨ存在四种形式的 同工酶，包括细胞质ＩＣＤＨ（ｃｙｔｌＣＤＨ）、线粒体ＩＣＤＨ （ｍｉｔｌＣＤＨ）、叶绿体ＩＣＤＨ（ｃｈｌＩＣＤＨ）和过氧化物酶体
ＩＣＤＨ（ｐｅｒｌＣＤＨ）。其中ｃｙｔＩＣＤＨ和ｍｉｔｌＣＤＨ的基因已
经被鉴定，而ｃｈｌＩＣＤＨ和ｐｅｒＩＣＤＨ的基因尚未有明确 报道。
关键词：高等植物；异柠檬酸脱氢酶；ＮＡＤＰ；分子进化；功能
中图分类号：Ｑ５５４．５
文献标识码：Ａ
文章编号：１００８—９６３２（２００９）０３—００４５一０４
异柠檬酸脱氢酶（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ，ＩＤＨｓ） 可以催化异柠檬酸氧化脱羧形成ｄ一酮戊二酸，同时形 成ＮＡＤＰＨ。ＩＤＨｓ蛋白超家族古老而庞大。最近的分子 系统学研究显示，ＩＤＨ—ＩＭＤＨ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏ— ｇｅｎａｓｅ）超家族可分为ｉ个单源性亚族：Ｉ型ＩＤＨ、Ⅱ型 ＩＤＨ、ＩＭＤＨ及相关酶类¨’２Ｊ。根据辅酶特异性，ＩＤＨｓ分 为ＮＡＤ一依赖型的ＩＤＨ（ＮＡＤ—ＩＤＨ；ＥＣＩ．１．１．４１）和 ＮＡＤＰ．依赖型的ＩＤＨ（ＮＡＤＰ．ＩＤＨ；ＥＣｌ．１．１．４２）。在植 物细胞中，ＮＡＤＰ—ＩＤＨ（简称ＩＣＤＨ）分布于细胞质、叶绿 体、质体、线粒体以及过氧化物酶体。ＩＣＤＨｓ催化合成 的仅．酮戊二酸可为植物对氨的同化提供碳骨架，而 ＮＡＤＰＨ可以维系细胞内的氧化还原平衡，帮助植物抵 御氧化胁迫。目前ＩＤＨ是困际上公认的研究蛋白质结 构与功能关系、酶的催化与调节机制、蛋白质分子进化 机制的最好模型之一。 １植物ＩＣＤＨ同工酶的表达及其酶学特性
植物ＩＣＤＨ也采用同样的调节机制。
表Ｉ 不同定位的植物ＩＣＤＨ同工酶对底物的Ｋｍ值
Ｔａｂｌｅ １ Ｋｍ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｙ ＩＣＤＨ ｉｓｏｅｎｚ３，ｍｅｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ．
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ＩＣＤＨ、ＧＳ和ＮＡＤ一依赖型ＧＤＨ在植物氨同化和碳
代谢中发挥着重要作用”。】。研究发现，在低温条件
下，ＩＣＤＨ和Ｇｓ的活性分别提高了７５％和８０％¨１。
植物氨同化所需的仅一酮戊二酸的碳骨架来源一直存
在争议。有的认为线粒体ＮＡＤ．ＩＤＨ是ｄ．酮戊二酸的
来源，但线粒体ＮＡＤ．ＩＤＨ在体外可测定的活力非常
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收稿日期：２００８—０３—２５ 作者简介：王鹏（１９８３一），男，硕士研究生，专业方向：植物分子生物学，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｐｅｎ９９９＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ’ 通讯作者：朱国萍，教授。博士生导师，主要从事蛋臼质功能进化与分子生物学研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｇｐｚｌ９９６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ。 基金项目：国家自然科学基金（．３０５００３００）；教育部新世纪优秀人才支持计划（ＮＣＥＴ－０６－０５５８）；安徽省优秀青年科技基金（０６０４３０８９）；安徽
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２植物ＩＣＤＨ的分子系统进化关系
现有的ＤＮＡ数据库中仪包含三个核编码的植物 ＩＣＤＨ基因。在拟南芥中，ｉ条编码ＩＣＤＨ同工酶的基
因均为保守的１５个外显子／１４个内含子的结构。
Ａｔｌ９６５９３０编码ｃｙｔｌＣＤＨ，其氨基酸序列和烟草ｃｙｔｌＣ— ＤＨ有很高的同源性。Ａｔｌ９５４３４０可能编码ｐｅｒｌＣＤＨ， 因为其氨基酸序列Ｃ端含有典型的Ｉ型过氧化物酶体
守Ｈ１。Ｎｅｋｒｕｔｅｎｋｕ等人研究发现真核乍物ｍｉｔＩＣＤＨ和 ｃｙｔｌＣＤＨ起源于独立的基因倍增。我们最新构建的分
子进化树显示，微生物、动物及植物的ＩＣＤＨ分别聚在
各自的进化枝上（图１）。植物ｍｉｔｌＣＤＨ、ｐｅｒｌＣＤＨ和 ｃｙｔｌＣＤＨ也分别聚在相应的植物线粒体、过氧化物酶 体及细胞质的进化枝上。如图中所示，植物ｍｉｔｌＣＤＨ 和ｃｙｔｌＣＤＨ与植物其它ＩＣＤＨ同工酶的进化关系更近，
定位的模体结构，即ＳＲＬ ｉ肽结构。Ａｔ５９１４５９０可能 同时编码ｍｉｔＩＣＤＨ和ｃｈｌＩＣＤＨ，与烟草ｍｉｔｌＣＤＨ的编
码基因为异源同型基因。虽然在其它物种中，如放线 菌构巢曲霉（ＡｓｐｅｒｇｉＵｕｓ ｎｉｄｕｌａ瑚）中的三种ＩＣＤＨ同工 酶由一个基因编码，人细胞ｃｙｔｌＣＤＨ和ｐｅｒｌＣＤＨ也由
柠檬酸氧化脱羧的过程中形成ＮＡＤＰＨ，为植物细胞
的新成代谢提供还原力。
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在植物体的不同部位，ＩＣＤＨ的丰度存在差异。 如在紫花苜蓿的提取物中，节结部位的ＩＣＤＨ的活性 最高，其次为根、花芽、茎及叶片。在大豆和马铃薯的 根部，总ＩＣＤＨ活性最高。但是特异性３’端ＤＮＡ探针 对ＩＣＤＨ同工酶ｍＲＮＡ的检测显示，烟草茎巾的ｃｙｔ— ＩＣＤＨ较丰富，其次是花、根及叶片。而且ｃｙｔｌＣＤＨ在 烟草和马铃薯叶脉中的丰度高于叶肉细胞。
近年来的研究表明植物ＩＣＤＨ是细胞ＮＡＤＰＨ的 重要来源之一。ＮＡＤＰＨ是组成细胞生化网络核心的 重要成员之一，它主要为生物合成提供还原力一Ｊ。Ｉｃ． ＤＨ合成的大量ＮＡＤＰＨ可以维持植物细胞的抗氧化 系统，以抵御因活性氧（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ， ＲＯＳ）积累造成的氧化胁迫，还可以维系细胞质和线 粒体之间的氧化还原平衡，并对谷胱甘肽还原、细胞 的凋亡与衰老等生理过程起重要的调节作用。
但有一些实验结果认为植物ＩＣＤＨ与氨的吸收同 化没有关联。植物主要在叶肉细胞通过ＧＳ／Ｆｄ． ＧＯＧＡＴ途径吸收同化氨，而植物ＩＣＤＨ只选择性的分 布在维管组织中。当给短时间氮饥饿处理的烟草重新 供应氮或氨时，ｃｙｔｌＣＤＨ在ｍＲＮＡ水平上并没有发生 显著性变化，而线粒体ＮＡＤ—ＩＤＨ的表达却受到了诱 导，并且其它ＴＣＡ循环中的一些酶（如柠檬酸合酶和 乌头酸酶）也同样被诱导表达。另外在反义ＲＮＡ技术 构建的转基因土豆中，ｃｙｔＩＣＤＨ的活力显著降低。只 占细胞总ＩＣＤＨ活力的８％，但烟草的生长、开花、光 合作用、光呼吸和蛋白含量均没有受到影响，碳、氮代 谢也没有显著变化，仅有细胞中的柠檬酸和异柠檬酸 含量增加了２—２．５倍，以及六碳糖含量在黑暗条件 下减少了，因此认为ＧＳ／Ｆｄ—ＧＯＧＡＴ途径不需ＩＣＤＨ。 ３．２植物ＩＣＤＨ产生的ＮＡＤＰＨ与氧化胁迫
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对１５种植物叶片提取物中的ＩＣＤＨ同下酶进行的 活性比较，发现ｃｙｔｌＣＤＨ活力总是在植物细胞总ＩＣＤＨ 活力中占主导地位。如烟草细胞的ｃｙｔｌＣＤＨ活力占细 胞总ＩＣＤＨ活力的９５％，而植物细胞内其它＝三种ＩＣＤＨ 同工酶（ｍｉｔＩＣＤＨ，ｃｈｌｌＣＤＨ，ｐｅｄＣＤＨ）活性却很低。
所有已纯化的植物ＩＣＤＨ均为同源二聚体，亚基 分子量约为４７ｋＤａ。植物ＩＣＤＨ同丁酶的动力学参数 很相似（见表１）。真核细胞ＮＡＤ－ＩＤＨ通过ＡＭＰ或 ＡＤＰ激活因子介导的变构调节机制调节活性，植物 ＩＣＤＨ的活性受到ＮＡＤＰＨ的抑制，但不受别构剂的调 节【３ Ｊ。大肠杆菌ＮＡＤＰ．依赖型ＩＤＨ（ＥｃｌＤＨ）中的活性
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图１植物ＩＣＤＨ的分子系统进化图
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３．１植物ｃｙｔＩＣＤＨ与氨同化
而与动物ｍｉｔｌＣＤＨ和ｃｙｔｌＣＤＨ的进化关系相对要远， 进一步证实了动物或植物中不同细胞器的ＩＣＤＨ同工
酶均来源于各自祖先ＩＣＤＨ基因的独立倍增。
３植物ＩＣＤＨ的生理功能
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植物ＩＣＤＨ的生理功能一直争议最大，目前的两
种观点认为：（１）将异柠檬酸氧化脱羧，形成ｄ一酮戊
二酸，可能为氨的吸收同化提供碳骨架；（２）在将异
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生物学杂志 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＩ．ＯＧＹ
ＶｏＬ ２６ Ｎｏ．３ Ｊｕｎ，２００９
ｄｏｉ：ｌ Ｏ．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８－９６３２．２００９．０３．０４５
植物ＮＡＤＰ＋．依赖型异柠檬酸脱氢酶 的分子进化及功能研究进展
王鹏，赵品军，翟羽佳，朱国萍
（１安徽师范大学生物大分子进化重点实验室；２安徽师范大学分子生物学及生物技术研究所，芜湖２４１０００）