α-酮戊二酸(α-KG)可抑制异柠檬酸脱氢酶-1基因(IDH1基因)突变型致命脑瘤

Science：α-酮戊二酸(α-KG)可抑制异柠檬酸脱氢酶-1基因(IDH1基因)突变型致命脑瘤

在特定的脑肿瘤中，存在着编码IDH1的杂合性突变，但是这种突变在肿瘤发展中的机制尚不得而知。我们发现，来源于肿瘤中IDH1的突变损害了此酶对它的底物的亲和力，并通过催化无活性的异二聚体形成，明显的抑制了野生型IDH1的活动。培养细胞中突变的IDH1的强制表达减少了酶产物α酮戊二酸（alpha-KG）的形成，并增加了缺氧诱导因子亚单位α（HIF-1α）的水平。缺氧诱导因子亚单位α（HIF-1α）是一种转录蛋白，能在低氧环境中促使肿瘤生长，它的稳定性能被α酮戊二酸调节。在含有IDH1突变的人类胶质瘤细胞中，

HIF-1α的水平要明显高于那些不含IDH1突变的肿瘤细胞。因而IDH1似乎是作为一种肿瘤抑制因子而存在，一旦通过突变使之灭活，则可能会部分的通过

HIF-1α途径参与肿瘤的发生。

人类基因组有5种基因可以编码3种不同的IDH。其中IDH2和IDH3存在于线粒体中，参与三羧酸循环，只有IDH1存在于细胞质和过氧化物酶体中。有研究发现IDH1的突变是在R132位置存在一个单核苷酸取代了原来的精氨酸。

为了证明R132突变与肿瘤产生的关系，作者根据文献建立了IDH1的化学结构模型，发现R132的侧链和底物的α螺旋和β折叠之间形成3个氢键，而未变异的只形成2个氢键，这说明了R132的变异从空间的电子水平影响了酶与底物的结合。

比较在293T细胞中表达的三种R132上的变异，R132H;R132C;R132S。得出与野生型相比，他们的催化活性降低了大约80%。(方法：将在HEK393T 细胞中FLAG标记的野生型和突变型IDH1用免疫沉淀反应纯化，用FLAG肽洗脱；右图：HIS标记的野生型和突变型IDH1用镍树脂纯化)从大肠杆菌的纯化的重组R132同样显示出这种结果。这三种突变使IDH1与异柠檬酸盐的Km 值与野生型相比有很大的下降，但与NADP的Km值下降不明显，最大反应速率下降也不明显。可以得出IDH1突变使酶的活性和协同作用降低。

根据文献可知IDH1酶正常时应该是同二聚体形式，我们猜想IDH1突变的分子与野生型形成了异二聚体，为了验证这一假说，作者在大肠杆菌中用组氨酸标记的野生型IDH1和用FLAG标记的突变型共表达，用第一镍树脂提纯异二聚体。用凝胶过滤分离纯核野生，纯核突变和杂合突变。我们观察到WT:R132H 异二聚体展示出4%的活性。通常情况下，IDH1在催化过程中展示出3种不同的构象，我们的研究表明IDH1的突变影响了其构象的形成。这说明IDH1突变影响了他与异柠檬酸的亲和力。图2C说明降低了突变IDH1与异柠檬酸的协同作用。（异柠檬酸盐浓度不同时同二聚体和异二聚体的最大反应速率不同）

作者的下一步研究是IDH1的催化活性降低是否影响α-KG的水平，作者应用RNA干扰使得U-87MG细胞中内生性IDH1水平降低，来测定α-KG的水平。两种独立的短发卡RNA使得IDH1mRNA降低了75%，α-KG水平降低了50%。IDH1突变的水平跟我们做的模型水平差不多。我们可以得出IDH1突变引起α-KG剂量依赖性水平降低。综上所述:IDH1突变与野生型形成了异二聚体，导致了胞内α-KG水平降低。

因为脯氨酰羟化酶需要α-KG，这种酶可以促进HIF-1α的降解。我们假设IDH1的活性降低使得HIF-1α水平升高。我们发现HIF-1α的水平在短发卡RNA 介导的IDH1下降的细胞中水平升高（图3A）。同样的，野生型IDH1的过度表达使得HIF-1α蛋白水平降低。（图3B）。这些结果表明IDH1通过控制α-KG 水平来调节HIF-1α的水平。为了验证这一假说，我们给细胞注射octyl-a-KG，一种可以转变为α-KG的物质。我们发现octyl-a-KG抑制了HIF-1α的表达(图3C)。我们因此可以得出IDH1活性降低可以α-KG水平降低，从而使得HIF-1α更具稳定性。

我们的下一步研究是IDH1酶活性的降低是否引起HIF-1α目的基因的表达升高。HIF-1α是HIF-1中的重要组成部分，HIF-1是一个转录因子，它可以感受细胞氧水平，进而影响着糖代谢、血管生成等对肿瘤生长很重要的信号通路。定量PCR扩增HIF-1α对应的3个目的基因：Glut1、VEGF、PGK1的mRNA，表明IDH1的水平降低引起HIF-1α目的基因的表达。另外，IDH1的突变使得HIF-1α靶基因强烈的表达（图4A）。草酰苹果酸裂解酶，一种IDH1的竞争性抑制剂，也可以诱导HIF-1α目的基因的表达（图4B）。

最后，我们来验证在人类脑胶质瘤细胞中IDH1突变是否与HIF-1α水平升高有关。在收集的26例样本中，我们确定了8例含有R132H突变的肿瘤样本。应用免疫组化，我们比较IDH1突变的有无与HIF-1α表达的关系。我们发现8例含有R132H 突变的比12例未发现突变的细胞有更强的HIF-1α表达。在IDH1突变的肿瘤中，28.1%+-6.7%的细胞HIF-1α染色阳性，然而野生型IDH1肿瘤细胞中，只有

15.8%+-3.5%细胞染色阳性（p<0.001)(图4C)。IDH1突变的肿瘤也发现和没有IDH1突变的肿瘤细胞比较，在VEGF水平也有相似之处。

总而言之，我们发现IDH1的功能更像是抑癌基因而非致癌基因。其突变与野生型形成异二聚体而影响其功能。。。。。

IDH1与HIF-1α之间的联系提出了一个崭新的课题：即突变引起代谢酶改变通过刺激HIF-1α传导通路而导致肿瘤发生。。。。。。我们发现的KG衍生物水平可以使得HIF-1α水平减低，说明α-KG类似物可以作为IDH1突变的胶质瘤的治疗方法。