获得目的基因方法的选择为了研究基因全长结构
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Luria-Bertani（LB）培养基是一种不确定成分培养基 (undefined medium)，胰蛋白胨(tryptone)负责提供氨基酸以 及小的肽段，酵母提取物(yeast extract)负责提供氮源、糖以 及其他有机和无机营养。类似LB的混合培养基不需要补充其他 的营养成分，并且能够维持种类更多的细菌的生长。
There are three basic and two optional steps in a DNA extraction
1. Breaking the cells open, commonly referred to as cell disruption, to expose the DNA within, such as by grinding or sonicating the sample. 2.Removing membrane lipids by adding a detergent. 3.Removing proteins by adding a protease (optional but almost always done). 4.Removing RNA by adding an RNase (often done). 5. Precipitating the DNA with an alcohol — usually ethanol or isopropanol. Since DNA is insoluble in these alcohols, it will aggregate together, giving a pellet upon centrifugation. This step also removes alcohol-so基因 三、基因的化学合成
获得目的基因方法的选择
为了研究基因全长结构确 PCR/RT-PCR
若目的基因难以克隆且序列短小
用PCR方法获 得目的基因
Three distinct kinds of DNA are needed to be prepared:
total cell DNA; plasmid DNA; phage DNA.
3.1 全细胞DNA的制备(total cell DNA)
（1）培养细胞的生长和收集（harvested）； （2）细胞的破碎及内含物(content)的释放； （3）从细胞抽提物（cell extract）中除去DNA外 的其他所有成分； （4）DNA溶液的浓缩(concentrated)。
Refinements of the technique include adding a chelating agent to sequester divalent cations such as Mg2+ and Ca2+. This stops dnase enzymes from degrading the DNA.
用溶菌酶或EDTA来削弱细胞壁足以导致细胞破裂，但在某些条 件下，通常还要加入一些去垢剂如十二烷基磺酸钠（SDS）导 致细胞膜破裂，协助整个细胞外壁的溶解过程。
3.1.1 细菌培养物的生长和收集
培养细菌需要培养基（culture medium），可 分为确定成分和不确定成分培养基，M9和LB培 养基是两种典型的细菌培养基。
M9是一种确定成分培养基（defined medium），其中的所有 成分是可知的。这种培养基包含的无机营养成分（inorganic nutrients)的混合物为细菌的生长提供基本元素，如氮，镁和 钙，葡萄糖(glucose)提供碳源和能量。在实际应用中，还必须 向M9中添加额外的生长因子，如微量元素和维生素。需要添加 何种成分要视情况而定。
化学合成
Байду номын сангаас
基因的化学合成
已知部分cDNA序列 EST database
基因的电子克隆
第三讲 DNA的分离和纯化
DNA isolation/ extraction
DNA Extraction is the removal of deoxyribonucleic acid (DNA) from the cells or viruses in which it normally resides, it is a routine procedure to collect DNA for subsequent molecular or forensic analysis.
通过离心可以收集细胞。相对较低的转速就能够使细菌在离心 管（centrifuge tube）的底部聚集。
3.1.2 细菌提取物的制备
制备细胞提取物的第一步是使细胞裂解。裂解细胞 方法大体上可以分为两类：物理方法和化学方法。 物理方法指的是以机械力(mechanical forces)的 方法破碎细胞来释放内涵物。 化学方法则是用化学药品(chemical agents)对细 胞进行破碎。在制备DNA时通常以化学的方法破碎 细胞。
利用LB培养基，在37 ℃、150～250 r/min的条件下，培养大 肠杆菌细胞，大约每20 min分裂一次，直到培养基中的细胞达 到2×109～3×109个/mL的最大密度。培养物的生长状况可以通 过读取600 nm可见分光光度值（OD值）来监测，在该波长下， 每个单位的OD值相当于0.8×109 个/mL。
利用化学方法破碎细胞，所使用的试剂通常包括一种能够破坏 细胞壁的成分和一种能够去除细胞膜的成分。
对于大肠杆菌来说，常常使用溶菌酶(lysozyme)或者乙二胺四 乙酸盐（EDTA）破坏细胞壁，或者二者结合起来使用。溶菌酶 能够消化掉细胞壁中的多聚物，EDTA能够通过螯合除去对保护 整个细胞外壁来说必不可少的钙离子，同时抑制细胞质中降解 DNA的酶。
There are three basic and two optional steps in a DNA extraction
1. Breaking the cells open, commonly referred to as cell disruption, to expose the DNA within, such as by grinding or sonicating the sample. 2.Removing membrane lipids by adding a detergent. 3.Removing proteins by adding a protease (optional but almost always done). 4.Removing RNA by adding an RNase (often done). 5. Precipitating the DNA with an alcohol — usually ethanol or isopropanol. Since DNA is insoluble in these alcohols, it will aggregate together, giving a pellet upon centrifugation. This step also removes alcohol-so基因 三、基因的化学合成
获得目的基因方法的选择
为了研究基因全长结构确 PCR/RT-PCR
若目的基因难以克隆且序列短小
用PCR方法获 得目的基因
Three distinct kinds of DNA are needed to be prepared:
total cell DNA; plasmid DNA; phage DNA.
3.1 全细胞DNA的制备(total cell DNA)
（1）培养细胞的生长和收集（harvested）； （2）细胞的破碎及内含物(content)的释放； （3）从细胞抽提物（cell extract）中除去DNA外 的其他所有成分； （4）DNA溶液的浓缩(concentrated)。
Refinements of the technique include adding a chelating agent to sequester divalent cations such as Mg2+ and Ca2+. This stops dnase enzymes from degrading the DNA.
用溶菌酶或EDTA来削弱细胞壁足以导致细胞破裂，但在某些条 件下，通常还要加入一些去垢剂如十二烷基磺酸钠（SDS）导 致细胞膜破裂，协助整个细胞外壁的溶解过程。
3.1.1 细菌培养物的生长和收集
培养细菌需要培养基（culture medium），可 分为确定成分和不确定成分培养基，M9和LB培 养基是两种典型的细菌培养基。
M9是一种确定成分培养基（defined medium），其中的所有 成分是可知的。这种培养基包含的无机营养成分（inorganic nutrients)的混合物为细菌的生长提供基本元素，如氮，镁和 钙，葡萄糖(glucose)提供碳源和能量。在实际应用中，还必须 向M9中添加额外的生长因子，如微量元素和维生素。需要添加 何种成分要视情况而定。
化学合成
Байду номын сангаас
基因的化学合成
已知部分cDNA序列 EST database
基因的电子克隆
第三讲 DNA的分离和纯化
DNA isolation/ extraction
DNA Extraction is the removal of deoxyribonucleic acid (DNA) from the cells or viruses in which it normally resides, it is a routine procedure to collect DNA for subsequent molecular or forensic analysis.
通过离心可以收集细胞。相对较低的转速就能够使细菌在离心 管（centrifuge tube）的底部聚集。
3.1.2 细菌提取物的制备
制备细胞提取物的第一步是使细胞裂解。裂解细胞 方法大体上可以分为两类：物理方法和化学方法。 物理方法指的是以机械力(mechanical forces)的 方法破碎细胞来释放内涵物。 化学方法则是用化学药品(chemical agents)对细 胞进行破碎。在制备DNA时通常以化学的方法破碎 细胞。
利用LB培养基，在37 ℃、150～250 r/min的条件下，培养大 肠杆菌细胞，大约每20 min分裂一次，直到培养基中的细胞达 到2×109～3×109个/mL的最大密度。培养物的生长状况可以通 过读取600 nm可见分光光度值（OD值）来监测，在该波长下， 每个单位的OD值相当于0.8×109 个/mL。
利用化学方法破碎细胞，所使用的试剂通常包括一种能够破坏 细胞壁的成分和一种能够去除细胞膜的成分。
对于大肠杆菌来说，常常使用溶菌酶(lysozyme)或者乙二胺四 乙酸盐（EDTA）破坏细胞壁，或者二者结合起来使用。溶菌酶 能够消化掉细胞壁中的多聚物，EDTA能够通过螯合除去对保护 整个细胞外壁来说必不可少的钙离子，同时抑制细胞质中降解 DNA的酶。