角膜组织工程

组织工 程角膜
周边支架
陶瓷、氟碳聚合物、羟基磷灰石、生 物材料、聚四氟乙烯
角膜设计中，较为成功的是AlphaCor、
Dohlman-Doan和Osteo-Odonto， 并获得了 FDA 批准，进入临床阶段。
种子细胞特点
（1）具有较高的增殖能力
（2）能够长期维持其生理功能和生物活性
种子细胞（角膜缘干细胞）
羊膜作为移植底物，是提供基质，而不是移 植上皮活细胞.羊膜中含有Ⅳ型胶原蛋白（与 结膜中Ⅳ型胶原蛋白相同，可刺激杯状细胞 的分化）、整合素及板层体等多种成分，是 结膜上皮化的合适附着物，为病变组织提供 健康的上皮下基质环境.
展望
理想人工角膜应具有以下特点： ①优良的光学特性，稳定的物理化学性质。 ② 能够与自体角膜组织长期共存，并紧密结合。 ③无不良反应，并发症少。 ④手术简单，制作容易，经济实惠。 今后，人工角膜的研究重点是集中生物材料学、细胞 生物学、分子生物学及临床医学专家联合攻关，选 择真正生物相容性材料，改善光学镜柱和周边支架 的整合，更重要的是周边支架和受体组织的整合。
患者恢复眼表完整性和重建边缘屏障作 用的有效方法。
角膜缘干细胞移植的局限性
异体供眼来源有限，而且存在免疫排斥反应，可能
导致移植失败。 对单眼角膜缘干细胞受损患者的健眼取材（大于 2/3圆周）有造成健眼角膜缘干细胞缺乏的潜在威 胁 。
因此目前认为对角膜缘干细胞先行体外培养扩增后
再行移植术是非常有前景的治疗方法。
3.移植
Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93
角膜缘干细胞理论的建立
1971年，Davanger等研究发现角膜缘是角
ห้องสมุดไป่ตู้
膜上皮增殖和移行的动力根源，据此提出 角膜缘干细胞存在的假说 。 1986年，Schermer等首次通过试验发现角 膜缘基底细胞缺乏特异性分化蛋白K3，为 角膜缘干细胞的解剖部位提供了间接依据。
羊膜
当胚体下沉，其周围的外胚层和中胚层向
上突起形成羊膜褶，头褶、尾褶向上生长， 侧褶向胚体背中部集中，最后，这些褶全 部在胚体尾端背部会合，将胚体全包在膜 内，内层称羊膜，羊膜腔内有羊水，外层 称浆膜，这两层膜在会合处形成浆羊膜缝。
生物羊膜
羊膜的制备和保存
将胎盘取出后，立即在层流罩下用含50mg/L
材料来源
活体捐赠
传统
尸体捐赠
活体捐赠
现代
尸体捐赠
人工角膜
活体捐赠顾名思义供体是活人，
因外伤、视神经疾患、颅内疾 患等原因导致失明（无光感） 而角膜却是完好无损的眼球， 均是合适的供体。
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人工角膜
基本简介 世界上超过1000万人的眼盲是由角膜病引 起，为导致眼盲的第二大原因，仅次于白内 障。其中80%可以通过角膜移植手术脱盲。 然而，传统的角膜移植手术有其两大弊端， 一是角膜供体的来源困难，二是手术成功率 低。人工角膜的出现及应用为角膜盲患者带 来了希望。
1.取材
取一块大小为1×2mm2，深度为基质前的 角膜缘组织一块。
Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93
2.培养 采用组织块培养法和酶消化法。所用的 培养基采用DMEM与F－12培养基1：1混合，加入 10％胎牛血清，5ng/ml的胰岛素，10 ng/ml的上皮 生长因子。消化酶使用0.25％胰蛋白酶－0.02％ EDTA的混合物。
基本结构
人工角膜是用医用高分子材料制成的类似人
体角膜的产品 。
无机材料 玻璃，羟基磷灰 石 ， 生物玻璃陶 瓷 硅凝胶 ，聚甲基丙烯 酸甲酯 ，氟碳多聚体 有机材料
人工角膜材料
生物材料
羊膜，动物胶原 和壳聚糖，黏多 糖
光学镜柱
聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA）、聚 甲基丙烯酸甲酯(PMMA）、硅凝胶、 玻璃
角膜缘干细胞的解剖定位
角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界的部分
在基底部乳头形成特殊的“栅栏”(limbal
palisades of vogt)样结构
角膜缘干细胞理论建立的意义
认知了多种眼表疾病的发病机理
找到了许多眼表重建手术及角膜移植术
失败的原因
角膜缘干细胞移植的意义
角膜缘干细胞移植是角膜缘干细胞缺乏
角膜移植
概念 用正常的眼角膜替换患者现有病变的角膜， 使患眼复明或控制角膜病变，达到增进视力 或治疗某些角膜疾患的眼科治疗方法。
适用症状
适合于各种原因造成的角膜混浊或水肿而严 重影响视力的病变 。 例如：病毒性角膜炎 被酸、碱化学物烧伤的角膜混浊患者 先天性角膜变性、圆锥角膜、角膜基质变性、 角膜内皮细胞功能失代偿等患者 角膜肿瘤、角膜瘘、角膜葡萄肿患者 已失明的角膜白斑患者
青霉素、50mg/L链霉素、100mg/L新霉素及 25mg/L两性霉素的平衡盐溶液清洗表面凝血 块.从绒毛膜间的潜在腔隙中钝性分离出羊膜， 将其上皮面朝上，平铺于0.45μm微孔硝酸纤 维素膜上，切成3cm×4cm大小，储藏于80℃，含有Eagle基质和甘油（1∶1）混合 液的无菌瓶内备用。鉴于羊膜的制作和保存 条件不足所带来的医用安全问题，灭菌生物 羊膜已上市并投入使用.
Chen J, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci,1990;31:1301
载体支架 的特点
（1）生物相容性好 ；
（2）细胞能够正常生长且形成近似体内器官
的正常结构 ； （3）具备角膜特有的透明，透光，透氧的特 性；
目前常用的载体支架
1 2 3 4 5 羊膜 胶原 纤维蛋白 脱细胞角膜基质 甲壳素与壳聚糖
Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93
观察培养细胞的生长情况 2－3天换液一 次，在倒置显微镜下观察角膜缘上皮细胞 的生长情况。
培养细胞标记物染色 将培养的角膜缘上 皮细胞固定，进行间接免疫组织化学染色。 选用AE5抗角蛋白抗体，特异性识别角蛋 白K3；4A4核转录因子p63的特异性抗体, 特异性识别p63。
疑问
（1）到底什么是角膜？
（2）常说的角膜移植是怎么回事？ （3）角膜移植中的角膜来源于哪里？
（4）盲人，近视，远视，白内障都可以 进行角膜移植而恢复视力吗？
角膜
眼角膜是眼睛前端一层透明薄膜 ，角膜完全 透明，位于眼球前部，呈横椭圆形。角膜有十分 敏感的神经末梢，如有外物接触角膜，眼睑便会 不由自主地合上以保护眼睛。
角膜分为五层，组织学上从前向后分为： ①上皮细胞层：厚约35μm，由5～6层鳞 状上皮细胞组成，无角化，排列特别整 齐，易与其内面的前弹力层分离； ②前弹力层：厚约12μm，为一层均质无 细胞成分的透明膜；
③基质层：厚约500μm，占角膜厚度的 90%，由近200层排列规则的胶原纤维 束薄板组成，其间有角膜细胞和少数游 走细胞，并有粘蛋白和糖蛋白填充； ④后弹力层：为较坚韧的透明均质膜，成 年人厚约10～12μm； ⑤内皮细胞层：厚5μm，为一层六角形扁 平细胞构成，细胞顶部朝向前房，基底 面向后弹力层。