瘦肉精检测原理及操作步骤(精)

一、测定原理
“瘦肉精”克仑特罗竞争酶标免疫检测方法快速测定的基础是抗原抗体反应。

酶联板的微孔包被有针对兔抗克仑特罗特异性抗体的羊抗体（第二抗体）。

加入兔抗克仑特罗特异性抗体（第一抗体）与第二抗体结合而被固定，洗涤后加入标准液或样品溶液与酶结合物（酶标记抗原），标准液或样品中的游离抗原与酶标抗原竞争兔抗克仑特罗特异性抗体上有限的结合位点。

通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标抗原，加入酶基质（过氧化脲）和发色剂（四甲基联苯胺）并孵育，结合到板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的底物。

加酸终止反应后，颜色由蓝色转变为黄色。

在单波长450 nm处测吸光度，吸收光强度与样品中的克仑特罗浓度成反比。

二、试剂盒的组成
每个盒中（包括标准分析孔）材料如下：
（1）1×96孔板（12排×8孔），包被有第二抗体（兔IgG抗体）；（2）6个标准液（300ul/瓶）为克仑特罗水溶液。

浓度分别为0 ng/kg、100 ng/kg、300 ng/kg、900 ng/kg、2700 ng/kg、8100 ng/kg；（3）1个克仑特罗过氧物酶标记物浓缩液12 ml（红色帽）；（4）1个克仑特罗抗体浓缩液12 ml（黑色帽）；（5）1个酶基质/发色剂11 ml（蓝色帽）；（6）1个反应停止液，1 mol/L硫酸14 ml （黄色帽）；（7）1个缓冲液25 ml，酶标记物及抗体浓缩液稀释用。

三、试验材料
1、设备
微孔板酶标仪（450 nm）、均质器、冷冻离心机、离心管（50 ml）、微量可调移液器（单道、八道）、RIDAC18柱、滤纸（0.45μm）。

2、试剂
甲醇（分析纯、100%）、50 mmol/LHCL、10 mmol/LHCL、50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.0）、500 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.0）、1 mol/LNaOH。

四、储存条件
试剂盒保存于2-8℃，不要冷冻。

不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与干燥剂一起重新密封。

标准物质和无色的发色剂对光敏感，避免直接暴露在光线下。

五、试剂变质的迹象
发色剂有任何颜色表明已变质，应当弃之。

0标准的吸光值小于0.6时，表示试剂可能变质。

六、样品处理
1、尿样
尿样一般不用处理，取20清亮尿样直接测定。

如果尿样混浊要过滤或离心至得到清亮尿样。

2、肝脏、肉样
粉碎的5g样品与25ml50 mmol/L HCL混合，振荡1.5 h，以达到均质的目的。

称6g均质物（相当于1 g肝脏），加入离心管中。

10-15℃条件下（非常重要）4000转/min或更高的转速离心15 min。

转移上清液到另一个离心管中，加300μl 1mol/L NaOH混合15 min。

加入4 ml 500 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.0），简单混合并在4℃保存至少1.5 h或过夜（非常重要）。

10-15℃条件下（非常重要）4000转/min或更高的转速离心15 min。

分离全部上清液（应是清亮的，非常重要），使其升至室温（20-24℃），然后用RIDAC18柱纯化。

RIDAC18柱纯化样品必须在室温条件下（20-24℃），并严格控制过柱时流速。

用3 ml甲醇洗涤柱子，控制流速为1滴/s。

用2ml洗涤液（50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH 3.0），洗涤柱子。

肝脏、肉样的全部上清液进柱，控制流速为1滴/4s。

用2 ml洗涤液（50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH 3.0），洗涤柱子，流速为1滴/s。

用正压除去残留的流体并用空气或氮气吹2 min，干燥柱子。

用1 ml甲醇洗脱样品，控制流速1滴/4s。

在50-60℃并在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇溶剂。

用1 ml蒸馏水溶解干燥的残留物，取20μl进行分析。

3、饲料
取10ｇ饲料样品，用10 mmol/LHCL溶解，连续震荡10 min，用滤纸过滤，在滤液中加入120μl 1mol/L NaOH进行中和，检查pH，用NaOH控制PH值在6.5-7.5之间，取上清液20μl进行分析。

稀释倍数为25（即含有0.04 g饲料样品/ml）。

七、测定步骤
第一步：所有试剂及样品在开始检测前必须回升至室温（20-24℃），测定操作在20-24℃下进行。

第二步：用盒中缓冲液以体积1﹕10的比例稀释实际用量的克仑特罗抗体浓缩液（黑色盖），稀释前轻轻混均抗体，不要猛烈振荡。

第三步：取出实验需要数量的微孔板条，足够标准和样品所用的数量，标准和样品做两个平行试验，记录标准和样品的位置。

剩余的微孔板条放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，置于2-8℃冷藏。

第四步：每个微孔中底部加100μl稀释后的抗体溶液，室温（20-24℃）孵育微孔板15 min，避免光线照射。

第五步：孵育的同时进行酶标记物的稀释，用盒中缓冲液以体积1﹕10的比例稀释实际用量的克仑特罗酶标记物浓缩液（红色盖），稀释前轻轻混均抗体，不要猛烈振荡，避光放置。

第六步：洗板，甩出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打，直到纸上无明显水迹（拍打3次），以保证完全除去孔中的液体。

用250μl蒸馏水充入孔中，再次甩掉微孔中液体，并在吸水纸上拍打，重复操作两次。

加洗涤水的移液器管尖必须置于微孔上方约0.5 cm处打出洗涤水，避免将板孔中的游离抗体带入洗涤水中。

洗板后立即进行下一步操作，不要让板孔干燥。

第七步：加入20μl标准或处理好的样品到各自的微孔底部，标准和样品做两个平行实验。

第八步：加入100μl稀释了的酶标记物至微孔底部，轻轻震荡微孔析并在桌面上作圆周运动以混匀。

移液器管尖不要接触到孔中的混合物，避免交叉污染。

第九步：室温孵育微孔板30 min，避免放置，尽可能每隔10 min轻轻振荡1次，准备好酶基质/发色剂，并注意避光放置。

第十步：洗板，同第六步。

在洗板过程中加洗涤水的移液器置于微孔板上方0.5 cm处打出洗涤水，避免将板孔中的游离酶标记物带入洗涤水中。

第十一步：不要让板孔干燥，迅速加入100μl酶基质/发色剂到每个孔中，步骤操作要迅速，避免头尾反应时间相差过长，轻轻振荡板并在桌面上作圆周运动以混匀。

移液器管尖不要接触微孔中的混合物，避免交叉污染。

第十二步：室温暗处孵育微孔板15 min，暗处避光放置，同时准备好反应停止液。

第十三步：每孔加入100μl反应停止液，混匀，60 min内用酶标仪测量450 nm 处波长吸光度值。

八、结果
所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100，并且以百分比的形式给出吸光度值。

吸光度值（％）＝×100
计算的标准值（吸光度值）绘成一个对应克仑特罗浓度（mg/kg）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在200-2000 ng/kg范围内应当成为线性。

相对应每一个样品的浓度（ng/kg）可以从校正曲线上读出。