γ-聚谷氨酸发酵关键技术的研究

γ-聚谷氨酸发酵关键技术的研究

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是微生物合成由谷氨酸单体缩合形成的高聚物,单体间以酰胺键相互连接,具有多种优良特性,如无毒、生物可降解、生物相容、强溶于水等,广泛用于食品、环保、农业等领域。本文从γ-PGA生产菌的诱变选育和发酵过程优化展开研究,以期提高γ-PGA产率。主要研究内容如下:(1)采用ARTP 技术对出发菌株L13进行诱变处理,诱变条件为:处理距离2 mm、最佳处理时间300 s、样品加量10μL、通气量10 SLM。

以不产生脂肽和γ-PGA高产作为筛选标准,从突变库中筛选获得一株性能

优良的突变株ZF5。通过摇瓶发酵与5 L罐分批发酵验证,该菌株发酵过程仅产生少量泡沫,不产生脂肽副产物,在5 L罐中发酵18hγ-PGA产率达到26.1 g/L。

(2)在对枯草芽孢杆菌ZF5发酵特性研究基础上,通过添加适量的金属离子、氨基酸对γ-PGA发酵进行调控,以提高γ-PGA产率。

结果发现:Ca2+、Mo6+能够促进菌体的生长和γ-PGA的生物合成,最适浓度分别为0.1 g/L和0.06 g/L;Zn2+对菌体生长和产物合成都无显著影响;Cu2+和Mn2+对菌体的生长有一定抑制作用,但是Mn2+对γ-PGA产物积累促进作用最强,添加0.3 g/L的Mn2+发酵24 hγ-PGA产率最高为28.5 g/L,较对照提高了11.8%。谷氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸对γ-PGA的合成具有促进作用,其中谷氨酸、天冬氨酸效果更为显著。在发酵初始添加3 g/L的L-谷氨酸可使γ-PGA产率提高23%,最高达到31.5 g/L;在稳定期添加5 g/L的L-天冬氨酸可使γ-PGA产率提高17.6%,达到30.7 g/L。

(3)通过单一pH控制发酵策略研究发现,菌株ZF5最适生长pH为6.5,产物γ-PGA积累的最适pH为7.0。通过两阶段pH控制策略有效地实现了菌体快速生

长和γ-PGA合成最大化。在5 L罐中分批培养,前10 h将pH控制在6.5,之后恒定为7.0,菌体得以快速生长,同时γ-PGA产率最高达到32.6 g/L,较pH 7.0恒定发酵策略产率提高了24.9%,周期较短。

(4)结合pH分阶段控制策略,在5 L罐中采用分批补料发酵技术研究了葡萄糖、酵母膏、谷氨酸钠补料对发酵过程的影响。结果表明:葡萄糖、酵母膏、谷氨酸钠的最适初始浓度分别为100、10、20 g/L,补加量分别为100、10、50 g/L,对γ-PGA合成有明显的促进作用。葡萄糖、酵母膏的最适补料时间为对数末期(约17 h),谷氨酸钠的最适补料时间为对数中期(约14 h)。

经过优化,γ-PGA产率最高达到52.3 g/L,发酵周期28 h,较分批发酵产率提高了60.4%。