大豆蛋白的提取与含量测定(精)

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大豆蛋白的提取与含量测定
指导老师 王国彦
序言
蛋白质化学实验
蛋白质是一切生物体内重要的组成成份,蛋白质是由 二十多种氨基酸以肽键相互联接而成的复杂的高分子 化合物,溶于水时形成亲水胶体溶液。在酸碱和酶的 作用下,蛋白质被水解成胶胨肽最后形成氨基酸。 蛋白质分子依靠氢键、盐键等副价键维持一定的空间 构型。在各种物理化学因素影响下,由于副价键的破 裂,使其空间结构遭受不同程度的破坏,蛋白质的物 理化学性质和生物学活性也随着改变。该现象称为蛋 白质的变性。
试剂和器材
1、材料: 本实验所提取大豆蛋白水提取液,经合适稀释至可测 定范围。 2、试剂: (1)0.03mol/L PH7.8的磷酸缓冲液。 (2)200μg/ml的标准酪(牛血清)蛋白溶液。 (3)Folin试剂甲:(俗称碱性铜试剂):10g NaoH溶于400ml水中,再加50gNa2CO3; 称 取 0 . 5 g 酒 石 酸 钾 钠 溶 于 8 0 mlH2O 中 , 再 加 0.25gCuSO4;以上两溶液混合定容到 500ml,冰箱 保存可用一个月。
试剂和器材
1、试剂 (1)10%Nacl (2)0.2%NaoH (3)75%乙醇 (4)6mol/L HCL (5) 1mol/L HCL (6)1 mol/L NaoH 2、器材 (1)离心机 (2)烧杯 (3)滴管 (4)PH试纸等
操作方法
1、水抽提 将豆粉5g用约40毫升左右的蒸馏水少量多次的添加搅 拌 , 常 温 下 搅 拌 抽 提 1 5 min, 3800r/min 离 心 15min,取上清液,如上清液不清澈再经过滤。 取上清液1毫升稀释50倍留做蛋白测定。 其余清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮,用滴管少 量多次慢慢滴加(搅拌)6mol/L和1 mol/L HCL, 调 PH4.5~5.0,3800r/min,离心 15min,收集沉 淀物,反复用丙酮搅拌洗涤离心2次,得到粉末状蛋白 质干粉,称重,计算粗产率。
4、Folin试剂乙:在2升磨口回流装置的烧瓶内,加钨酸钠 ( NaWO4· 2H2O)100g,钼酸钠( NaMoO· 2M2O)25g, 蒸馏水 700ml,85%的磷酸 50ml,浓盐酸 100ml,充分 混合后,小火回流 10 小时,再加硫酸锂( Li2SO4)150g, 蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾15min,以驱除过量 的溴,冷却后定容到1000ml,过滤后呈金黄色,于棕色并 中保存,可使用多年。 上述制备的 Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右, 几种操作方案都是把 Folin试剂乙稀释至1mol/L的酸度作为 应用液,我们是把贮备液于作用前稀释 18 倍,使之浓度为 0.1mol/L 略高。这种稀释 18 倍后的 Folin 试剂乙就是下文称 之为应用液, Folin试剂乙贮备液浓度的标定,一般是以酚 酞 为 指 示 剂 , 用 Folin 试 剂 乙 去 滴 定 1 mol/L 左 右 的 标 准 NaOH溶液,当溶液颜色由红变为紫灰色,再突然变成黑绿 既为终点。如果用 NaOH 去滴定 Folin 乙,终点不太好掌握, 溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色,再变为灰紫色为终点。
蛋白质性质与应用技术关系图
肽 氨基酸
疏 水 性 低 层 析 亲 水 性 极性
酸 碱
酶 离子交换层析 电荷 电泳
蛋白质
形 状
分 子 量
离ຫໍສະໝຸດ Baidu心
凝 胶 层 析
一、大豆蛋白的提取
目的要求
1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法 2 、计算粗提产率 2、学习计算蛋白质收率
实验原理
大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同,可以分为水溶 蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂 提取,并用有机溶剂沉淀,可制得各部分蛋白质的干粉。本实验 主要是水溶提取大豆蛋白。 称出提出蛋白质的重量,已知原料重量,可以求出蛋白质的收率。
由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸还原呈兰色,溶液 兰色的深浅与蛋白浓度有较好的线性关系。因此用 Folin酚法测定蛋白质含量,灵敏度较高。 样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用,如果样 品酸度较高则显色较浅,要提高碳酸钠一氢氧化钠的 浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸和色氨酸的浓度。 Folin酚法有不少具有操作方法,但基本原理都是一个, 只是在各溶液的浓度及填加量上,保温的温度及保温 时间上有所不同而已,本实验所介绍的是本室常用的, 灵敏度较高的操作方法。
蛋白质产物重量 蛋白质产率= ×100% 原料总重量 思考题 1、用丙酮沉淀蛋白时,为何要调PH4.5~5.0? 2、大豆中哪类蛋白含量最多?
Folin酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分
Folin酚法测定蛋白质含量
目的要求
掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法 蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质,如比重、紫外吸收,折射率等测 定而得知;或用化学方法,如定氮、双缩脲反应,Folin酚试剂反应等方法 来计算。也可以用染色法,如氨基黑,考马斯亮蓝法测定。还可以用荧光 激发法,氰胺 ,放射性同位素计数等灵敏度较高的方法。在这些方法中, 其中双缩脲法和Folin酚法是一般实验室中常用的方法,它们操作简便,迅 速,不需要复杂而昂贵的仪器。Folin酚法灵敏度高,比双缩脲法灵敏100 倍。 原理 Folin酚法是所用试剂是由两部分组成,试剂甲相当于双缩脲试剂,蛋白质 中的肽键在碱性条件下可与铜离子起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨 酸在碱性条件下不稳定,易被酚类还原而呈兰色(钼兰和钨兰混合物)。
蛋白质分子是含有酸性基团和碱性基团的两性电解质,在等电点 时,蛋白质分子的酸性基团和碱性基团的解离度相等,成为带有 正负电荷相等的两性离子,在电场中不向两极移动,并且极易沉 淀。氨基酸组成不同的蛋白质,具有不同的等电点。根据在一定 条件下(如 PH,离子强度等)它们所带电荷的数量和种类,分 子的大小及形状等方面的差异,可以采用电泳,离子交换柱层析 等方法对它们进行分离分析。 许多物理化学因素可以改变蛋白质在水中的溶解度,产生可逆或 不可逆沉淀,这些因素(如增加溶液的离子强度,降低溶液的介 电常数,调节溶液的 PH 等)以及一些沉淀剂和胶附剂也常用来 分离,提纯蛋白质或除去蛋白质。为了更好地使同学们运用和掌 握好理论和实践相结合,把学到的理论应用到实验中,本系列实 验安排是从一种生物中提取蛋白质,通过各种物理化学性质使其 得到纯化,得到蛋白质,并进行浓度测定,计算其收率。
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