实验四-尿标本的微生物学检验

定量培养
直接计数
BA、中国蓝或麦康凯平板（常规培养）
35 ℃ 18～24h
直接药敏试验
观察菌落形态、涂片染色镜检
血清学鉴定 生化鉴定 确定病原菌
药敏试验
发报告
• 检验程序：
革兰阴性杆菌
氧化酶（Oxi）
-
+
肠杆菌科细菌
非发酵菌
氧化酶阴性非发酵菌：不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌。 氧化酶阳性其他革兰阴性菌：巴斯德菌、气单胞菌、邻单胞菌
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应用：
肠杆菌科除某些生物型与欧文菌属外，均还原硝酸盐为 亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生 氮气，需加入锌粉证实。阳性对照菌为大肠埃希菌，阴性对照 菌为醋酸钙不动杆菌无硝变种。
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七、实验结果：
KIA
硝
菌名
气
乳/葡 H2S 体
Gas
酸 盐 还 原 试
甲 吲基 哚红
MR
文献名及每篇文献中前五种常见菌。 2、尿液标本分离培养选择Mac的目的？ 3、产气肠杆菌尿素酶试验出现假阳性的可能原
无菌空平皿
倾入10～15ml加热融化并冷至50 ℃
±的无菌营养琼脂，混匀
35℃培养18～24h。
0.1ml 尿液
9.9ml NS 1:100稀释标本0.1ml 总稀释倍数1:1000
四、结果观察：
1、细菌计数 1）结果记录： 2）结果计算： 每ml尿液细菌数=菌落平均数×稀释倍数 3）结果判断标准：
• 意义： 本试验应用广泛，如奈瑟菌属、假单胞
菌属、莫拉菌属呈阳性，肠杆菌科细菌呈 阴性。 2、触酶试验：
六、生化鉴定： 将1#、2#、3#标本分别接种于KIA、 、蛋
白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐斜面、 尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸盐蛋白胨水中， 置35℃培养18～24小时。
1、KIA（克氏双糖铁）试验： • 原理
4、其它：无菌空平皿、载玻片等。
• 实验方法：
一、分离培养
用无菌方法将1#、2#、3#模拟尿液标本分别划线接种于BA、 Mac上，置35℃培养18—24小时。
二、直接涂片染色
取上述1#、2#、3#标本分别作涂片、革兰氏染色、镜检。（要 求绘图并描述）
三、细菌计数（倾注平板法）
0.1ml尿液 9.9ml无菌NS 混匀 取0.1ml（1:1000稀释）标本
以下几种情况均可使尿液中菌数 ＜104/ml：
（1）应用了低敏感性抗菌药物，尿液中细菌受到一定抑制。 （2） 患者大量输液或使用利尿剂后。 （3）尿液pH值失常，当pH＜5.8或pH＞8.5时，细菌生长受阻。 （4）尿频时，膀胱内的菌停留时间短则细菌数少。 （5）某些菌的繁殖能力低。
2、菌落形态描述：（BA、Mac分别描述）
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6、尿素酶试验
• 原理：产生尿素酶的细菌，分解培养基中的尿素，产 生碳酸铵是培养基pH ，酚红由浅红色变成深红色。
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方法：直接观察结果。
结果：反应时间因细菌而异。培养基变
成深红色为阳性。
应用：肠杆菌科细菌的鉴定。
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7、苯丙氨酸脱氨酶试验： • 原理：
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方法：
待检菌大量接种于苯丙氨酸 琼脂斜面上，培养后在斜面上 直接加4～5滴10％氯化铁试剂， 出现绿色为阳性，立即观察， 为可逆反应。
没有过多的生气，因为这只是一个很 普通的 杯子， 也不值 什么钱 。摔碎 了就摔 碎
了，自己刚好还可以换一个新的杯子 。
汪娟不好意思地拿出一个一模一样 的
杯子，她有些难为情地说，“对不起， 我今天 收拾的 时候摔 碎了你 的杯子 ，所以 我
买了一个一模一样的给你，我希望你 不要介 意。”
小凤也觉得不好意思，“这
1#标本： 2#标本：
BA： Mac：
3#标本：
3、菌体形态观察：
分别取1#、2#、3#标本的BA、Mac培养物涂片、革兰染色、 镜检 。（要求绘图并描述、对比BA、Mac菌体形态差异）
五、鉴别试验:
1、氧化酶（Oxidase）试验： • 原理：
氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸 酶。氧化酶试验中，酶并不直接与试剂（1%盐酸四甲基对苯二胺或 1%盐酸二甲基对苯二胺）起反应，而是首先使细胞色素c氧化，然 后氧化型细胞色素c使对苯二胺氧化，出现显色反应。 • 试剂：1％盐酸四甲基对苯二胺或 1％盐酸二甲基对苯二胺 • 方法：直接法和试剂纸片法 直接法：用滤纸片刮取待检菌菌落（切勿刮到培养基），在有菌的 位置滴加氧化酶试剂，1分钟内观察结果。 • 结果判断：立即出现红色，继而逐渐加深为阳性（盐酸四甲基对苯二 胺呈现蓝紫色为阳性），不变色为阴性。
摔碎了。她打算去买一个一模一样的 杯子赔 给她。
这个杯子的主人叫做小凤
，她出去买东西了，还不知道自己的 杯子被 别人摔 碎了。 她本来 是一个 很好相 处
的人，但是大家才见面，彼此不知道 对方的 底细。 所以， 汪娟在 一个小 的精品 店
里面找到了同样的茶杯。 小凤回到宿舍以后，发现自己的杯 子被摔 碎了。 她
和弧菌属等也是氧化酶阳性。
• 麦康凯平板（Mac）： 是一种肠道杆菌专用的弱选择性培养基。培养基
成分中除基础成分外，主要含有0.5%胆盐、1%乳糖、 中性红指示剂。 胆盐：一方面对沙门氏菌有刺激生长作用，另一方 面对革兰氏阳性菌及大肠埃希氏菌有抑制作用。 1%乳糖：作为一种指示糖。 中性红指示剂：pH6.8—8.4，由红—黄。 （分解乳糖的细菌产酸，使菌落周围胆盐堆积变浑浊）
• 标本采集方法常有五种：导尿法、中段尿采集 法、肾盂尿采集法、膀胱穿刺采集法、留尿法。
1）导尿法：采取导尿管导尿，是一种较好的无菌采集法，可直接 插导管采集尿液标本或滞留导管集尿。直接导尿先让尿流弃 15ml，滞留导管集尿先用70%酒精消毒导管口再用针筒抽取， 取尿量为10～15ml，直接导尿有将尿道细菌进入膀胱的危险， 尽量避免此方法。
吲哚、丙酮酸 和氨
玫瑰吲哚
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方法: 结果:
应用：用于肠杆菌科细菌的鉴定。
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3、甲基红试验（MR试验） 4、VP试验
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原理：
变色范围4.4～6.2
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方法及结果：
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甲基红实验结果
阴性 阳性
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VP实验结果
阳性 阴性
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应用：
主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
MR VP 大肠埃希菌 ＋ － 产气肠杆菌 － ＋
2）中段尿采集法：目前国内临床常用此法。女性病人先用肥皂水 或1:1000高锰酸钾水溶液冲洗外阴及尿道口；男性病人应翻转 包皮冲洗，用1:1000新洁尔灭消毒尿道口；用无菌生理盐水或 无菌水冲去消毒液，再用灭菌纱布擦干，让病人排尿，弃去前 段尿，收集中段尿10～20ml，置于无菌容器内，立即加盖送检。
实验四
尿标本的微生物学检验
• 实验目的： • 掌握尿液标本的采集与处理、常见病原菌
及一般微生物学检验程序和细菌计数方法。
• 掌握大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌的微 生物学鉴定方法和生物学性状。
• 尿标本的采集与处理： • 正常人的尿液通常是无菌的，但在外尿道除有
正常菌群外，尚有其他一些病原菌和条件致病 菌，可通过多种途径引起尿路感染（urinary tract infection, UTI ）。如：葡萄球菌、链球菌、 肠球菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌等。
• 通常取晨起第一次尿送检。 • 由于治疗所用药物多数均通过尿液排泄，因此，无论
用何种方法采集尿液都宜在用药前进行。
• 尿液标本的采取和培养最大的问题是污染杂菌，故应 严格进行无菌操作
• 尿液标本中不得加防腐剂，否则会影响检出的阳性率。 • 尿液标本采集后要立即送检（常规2h内）或存放于
4℃冰箱（不超过24h，教材规定为8h），因搁置时间 稍长尿中病原菌可在室温中增殖，而影响细菌计数的 正确性。应注意淋病奈瑟菌培养时标本不能冷藏保存。
• 实验器材：
1、标本：1#、2#、3#模拟尿液标本。 2、培养基：BA、Mac、普通营养琼脂、KIA、蛋白胨水、
葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐斜面、尿素、苯丙氨酸斜面、 硝酸盐蛋白胨水。
3、试剂：9.9ml无菌生理盐水、革兰染液、氧化酶试剂、 3%H2O2、靛基质试剂、甲基红试剂、VP甲液、VP乙液、 10%FeCl3、硝酸盐还原试剂甲液、硝酸盐还原试剂乙液。
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※ IMViC
I: 吲哚试验 M: 甲基红试验 V: V-P试验 C: 枸橼酸盐利用试验实验
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5、枸橼酸盐利用试验
原理： 某些细菌能利用培养基中的枸橼酸钠作为唯一
的碳源而获得能量，能利用枸橼酸盐的细菌也能利 用铵盐作为唯一氮源，同时产生氨。分解枸橼酸盐 使培养基变碱性。 方法：直接观察结果。 应用：肠杆菌科细菌的鉴定
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结果判断：
阳性：加入试剂后30s变成红色，表明有亚硝酸盐存在， 表示硝酸盐还原试验阳性。
阴性：加入试剂后没有颜色反应，可能是： ①硝酸盐没有被还原(真阴性反应)； ②Байду номын сангаас酸盐被还原成非亚硝酸盐的其他产物 ，如NH3、
N2(脱硝作用)、NO或N2O和羟胺等。由于此试剂只检 测亚硝酸盐，上述产物会导致假阴性结果。因此，需 要加少量锌粉于阴性反应中，锌离子还原硝酸盐为亚 硝酸盐，加入锌粉后变成红色，表示有剩余的硝酸盐 存在，证明是真正的阴性反应。
V P
枸 橼 酸 盐
Cit
脲 酶
Ure
苯丙 氨酸 脱氨
酶
氧 化 酶 试 验
Pad
触 酶 试 验
验
大肠
艾希 A/A — +
+
菌
产气
肠杆 A/A — +
+
菌
变形 杆菌
K/A
+
+
+
+—
—
—
—
—
+
—+
+
—
—
—
+
+—
+
+
+
—
+
• 结果报告： 1#标本检出 2#标本检出 3#标本检出
• 实验讨论：
• 作业： 1、查5篇关于尿标本检验常见病原菌文献，例出
没什么，我本来就想换一个杯子。这 个杯子 就不用 陪给我 了。”
汪娟认真的说
：“这可不行，我特意买给你的，你就 收下吧 ，不然 我的心 里过意 不去。 ”
小
凤笑着说：“那好吧，这个杯子我就收 下了， 我们以 后就是 好朋友 了。”
汪娟
微笑着点点头。 小凤一直用着汪娟送给她的杯子，小 凤特别 喜欢这 个杯子 ，
1、营养非常丰富 2、葡萄糖：乳糖＝1：10 3、指示剂为酚红：变色范围6.0～8.6，
pH<6.0黄色，pH>8.6显红色
4、含有硫代硫酸钠 5、含有Fe 2＋
• 方法：直接观察结果。
只分解葡萄糖
结果判断
分解葡萄糖和乳糖 产生气体
产生H2S
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刚开学的时候，汪娟在收拾东西的时候 ，不小 心把同 寝室一 个同学 的杯子 给
尿标本中细菌的计数，主要是根据尿中细菌的多少来判断是否感染。 一般认为，细菌计数：＜104/ml为污染
＞105/ml为感染 104~105/ml为可疑
目前认为由革兰氏阴性杆菌引起的菌尿，其菌数均可达到＞ 105/ml，而球菌所引起的菌尿，其菌数达到104/ml，即可作为尿 路感染的标准（因不同细菌繁殖速度快慢不一，在同一时间内 细菌繁殖数应该是：革兰氏阴性杆菌＞葡萄球菌＞肠球菌）。 为此，作菌尿计数时，必须与涂片染色结果结合，作出报告。
• 常见病原菌： 医院内引起UTI的病原菌70%为革兰氏阴性
杆菌，其中以肠杆菌科和假单胞菌属的细菌为 主；革兰氏阳性菌约占20%，其中以葡萄球菌 和肠球菌为多见。由于抗菌素的广泛应用，近 年来真菌性UTI增多，约占10%。
• 检验程序：
尿标本
直接涂片染色
分离培养 细菌计数
（特殊细菌检查离心沉淀）
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8、硝酸盐还原试验 ：
原理 ：有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还 原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐与硝酸盐还原 试剂中的醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中对氨 基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸与α-萘 胺结合成红色的N-α-萘胺偶氮苯磺酸。
方法：在硝酸盐蛋白胨水培养物中分别滴加硝酸盐还原 试剂甲液和乙液各1～2滴，混匀，立即观察结果。
3）肾盂尿采集法：由泌尿科医生在膀胱镜下分别采 集左右侧输尿管的尿液，并做好标记，以防左右侧 错位，尿液采集量不少于1ml。
4）膀胱穿刺采集法：在病人耻骨上膀胱区用碘酒、 酒精消毒（要求病人不排尿充盈膀胱）以无菌针筒 做膀胱穿刺，抽取尿液后针筒插入橡皮塞送检。此 法主要用于厌氧培养。
5）留尿法：疑为尿道结核患者，可用一洁净容器， 留取24h尿液，取其沉淀部分盛于清洁瓶内送检。
她觉得这个杯子里面的水总是和其他 被子里 面的水 不一样 ，特别 的甘甜 。
小
凤好奇的
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• 结果表示：
不产酸－，产酸＋，产酸产气⊕
产酸A,产碱K
斜面/底层 H2S ＋/⊕ －
斜面/底层 H2S 产气 A/ A － ＋
－/⊕ ＋
K/ A ＋ ＋
2、吲哚（靛基质）试验:
原理：
色氨酸
色氨酸酶
吲哚
＋
对二甲基氨基苯 甲醛